单偏光显微镜下晶体的观察报告（基于微镜阵列的单透镜薄片荧光显微镜）

单偏光显微镜下晶体的观察报告（基于微镜阵列的单透镜薄片荧光显微镜）图1基于MMA的LSFM原理图和仿真结果。a） MMA的工作原理是将入射的荧光信号沿轴向定向到侧面检测摄像头。所有的微镜都有相同的反射角。b）LSFM中基于MMA的检测原理图：左上角的绿色箭头表示样本的扫描方向。OL：物镜；DM：分色镜；LWD：长工作距离物镜。c） MMA在XZ横截面上的入射信号振幅。d） MMA在XZ横截面上反射信号的振幅。e） YZ横截面上摄像头检测到的信号强度。色阶（c）–（e）中的值表示光场的强度。f）每个微镜收集的功率。高斯光束束腰的位置设置为聚焦在第三个微镜上。在这项工作中，我们展示了一种新的单目标光片荧光显微镜与微镜阵列（MMA）相结合。MMA由图1a所示的倾斜平板状微镜的一维阵列构成，其中示意图显示了如何使用MMA将收集的轴向荧光信号反射到横向，并检测到侧视摄像头。从图1a可以看出，MMA相当于共焦狭缝孔径阵列。然后，单物镜可用于激发和检测，充分利用物镜的

江苏激光联盟陈长军导读：

本文报道了一种基于微镜阵列（MMA）的LSFM，它可以实现单物镜的光片成像。由光片照明激发的平面荧光发射由同一物镜收集，中继到MMA上，并由侧视摄像头检测。该方案使LSFM与单目标成像系统兼容，并显示出良好的高时空成像性能。

传统的光片荧光显微镜（LSFM）利用两个垂直排列的物镜分别进行光学激发和检测。这种配置通常会限制高数值孔径（NA）物镜的使用，或者需要专门设计的长工作距离物镜。本文报道了一种基于微镜阵列（MMA）的LSFM，它可以实现单物镜的光片成像。由光片照明激发的平面荧光发射由同一物镜收集，中继到MMA上，并由侧视摄像头检测。该方案使LSFM与单目标成像系统兼容，并显示出良好的高时空成像性能。

1 介绍

光片荧光显微镜（LSFM）是一种功能强大的荧光成像方式，它利用侧面照明激发试样的光学剖切面，然后在垂直方向检测宽场信号。与逐点扫描相比，由于更高的光子收集效率、更低的光漂白和光毒性，平面激发和检测使LSFM成为一种高速成像方式。

光片荧光显微镜（LSFM）原理的示意图显示：（a）通过样品发光的光片和检测系统正交检测的荧光信号，（b）3D图像的记录，以及（c）多视图图像记录。

在大多数光片成像系统中，激发物镜和探测物镜相互垂直。因此，由于经常需要较长的工作距离，高NA物镜的使用通常受到限制。它还需要在垂直激励和检测方案中采用更复杂的样品安装技术。最近，为了克服两个目标垂直排列的局限性，人们探索了开发单目标LSFM的方法。这种倾斜照明采用单一目标进行激发和检测。因此，在这些方法中需要一个无像差的远程聚焦系统来解决倾斜荧光图像中的散焦问题。通过组合微/纳米制造设备，也可以实现在光片成像中使用单目标的替代方法。

在这项工作中，我们展示了一种新的单目标光片荧光显微镜与微镜阵列（MMA）相结合。MMA由图1a所示的倾斜平板状微镜的一维阵列构成，其中示意图显示了如何使用MMA将收集的轴向荧光信号反射到横向，并检测到侧视摄像头。从图1a可以看出，MMA相当于共焦狭缝孔径阵列。然后，单物镜可用于激发和检测，充分利用物镜的NA，如图1b所示。通过在一维方向（垂直于光片激发方向）扫描试样，可以获得MMA的三维成像。样品体积为100µm×88µm×20µm，横向分辨率为540 nm，轴向分辨率为2.4µm。

图1基于MMA的LSFM原理图和仿真结果。a） MMA的工作原理是将入射的荧光信号沿轴向定向到侧面检测摄像头。所有的微镜都有相同的反射角。b）LSFM中基于MMA的检测原理图：左上角的绿色箭头表示样本的扫描方向。OL：物镜；DM：分色镜；LWD：长工作距离物镜。c） MMA在XZ横截面上的入射信号振幅。d） MMA在XZ横截面上反射信号的振幅。e） YZ横截面上摄像头检测到的信号强度。色阶（c）–（e）中的值表示光场的强度。f）每个微镜收集的功率。高斯光束束腰的位置设置为聚焦在第三个微镜上。

2理论分析

使用光束传播法（BPM）从理论上分析了基于MMA的荧光成像的性能。模拟中的MMA模型设置为与实验中使用的模型相同，其中微镜沿光轴等距排列，并向光轴倾斜54.74°。反射镜的长度被认为足以覆盖光片激发的平面信号。

假设样品中只有一个荧光发射器，可以将其视为点源。通过物镜和中继光学系统采集后，假设MMA上的入射荧光信号分布为高斯分布。入射高斯光束束腰设置为754 nm，可被MMA的反射镜覆盖，并可通过成像光学元件进行实验调整，如图1b中的示意图所示。考虑到MMA浸没在介质中，模拟中还考虑了空气和介质之间的折射率差。入射高斯信号沿z方向的振幅分布如图1c所示，在BPM方法中以80 nm的步长计算。图1d显示了MMA反射信号的振幅分布。当信号从MMA反射出去时，使用侧视摄像头检测信号，信号的强度分布如图1e所示。提取每个微镜上收集的功率，如图1f所示，并应用高斯曲线拟合。由于微镜的倾斜角度和模拟中包含的折射率差，拟合曲线的峰值位置移动到19.6µm。

3单透镜LSFM的实验配置

实验配置如图2a所示。LSFM中的光片是通过一维扫描电流计扫描贝塞尔光束形成的，这可以提高LSFM的空间分辨率。与高斯光片相比，贝塞尔光片的最大优点是可以提供足够的照明范围，从而有效利用MMA的阵列检测能力。在我们的方法中，连续波激光产生的高斯光束通过轴棱锥变换为贝塞尔光束，然后用一维扫描电流计生成“光片”。通过相同的目标实现照明和检测。将不同轴向位置产生的荧光信号聚焦到不同的微镜上，并映射到科学互补金属氧化物半导体（sCMOS）上的不同位置。

图2 a）实验装置示意图。b）用一维电流计快速扫描生成数字光片的原理图。c） OL的样本激励和信号采集过程。绿色箭头表示激发光束，红色箭头表示荧光信号。d）信号被传输到MMA，并反射到最终侧视摄像头。MMA和sCMOS之间的部分在（d）中省略。红色箭头表示荧光信号，粉色箭头表示MMA反射的荧光信号。

4实验结果

在实验中，首次通过成像尺寸约为200 nm的量子点簇来表征该系统的点扩散函数。通过拟合量子点团簇的强度曲线，对该系统的分辨率进行了校准，如图3所示。

图3 单透镜薄片荧光显微镜空间分辨率的量化。a） XY平面上量子点团簇的图像。粉色线在X方向，绿色线在Y方向；（a）中右上角是代表性量子团簇的TEM表征。b）量子点簇在XZ平面上的图像，蓝线在Z方向。黄色虚线框中的右下角是（a）和（b）的原始图像；c–e）深蓝色曲线是分别在X、Y和Z维度上的彩色线上的强度分布。（c）–（e）以标准化比例绘制。每个维度的高斯强度拟合覆盖在相应的行中。（e）中显示的两个峰值是由于覆盖两个相邻micr反射镜的细长轴向场分布造成的。

为了验证贝塞尔光束在实验中的应用，通过快速扫描焦区中的单个金纳米粒子，测量了贝塞尔光束的三维分布。使用直径为10µm的荧光微球作为成像样品。首先用乙醇稀释微球，然后用紫外线胶将其固定在玻片上。图4a显示了一簇两个微球的亮场图像。图4b-d显示了示例的三维视图。为了抑制理论讨论中提到的实验中的串扰噪声，使用图3中测量的PSF进行反卷积。

图4直径为10µm的荧光微球的成像结果。a）两个直径为10µm的荧光微球的亮场图像。b–d）样品分别沿Z、Y和X方向的三维渲染成像；e）显示沿y轴和z轴分别对应于（f）和（g）的横截面切片方向的示意图；f）球体样品的横截面切片（XZ）；g）球体样本的横截面切片（XY）。所有比例尺均为10µm。

细胞成像采用COS-7细胞。COS-7细胞系来自非洲绿猴的肾组织。它通常用于病毒和转染研究以及细胞基因转录研究。选择美国Biotium公司的红细胞1号（RedDot1）作为细胞染色剂，这是一种细胞的远红色核染色剂。RedDot1染料在488-678nm波长的激发下发出远红色荧光，发射峰值为694nm。细胞的亮场成像如图5a所示，其中可以观察到细胞核和核膜的高浓度区域。数据采集和反褶积处理后，荧光成像的3D视图如图5b-d所示。沿XZ和XY方向的横截面切片分别如图5f、g所示，其中在高浓度区域可以观察到来自细胞核的更强荧光信号。

图5 COS-7细胞成像结果。a） COS-7细胞亮场图像；b–d）样品分别沿Z、Y和X方向的3D渲染成像；e）显示沿y轴和z轴分别对应于（f）和（g）的横截面切片方向的示意图；f） COS-7样品的横截面切片（XZ）；g） COS-7样品的横截面切片（XY）。所有比例尺均为10µm。

5总结和讨论

总之，我们展示了一种基于MMA的新型单透镜LSFM。使用单个高NA物镜进行激发和检测，提高了空间分辨率，使我们的方法与传统的激光扫描显微镜更加兼容。此外，使用离散微镜的功能类似于共焦显微镜。因此，报告的方法显示出良好的轴向分辨率。该方案还可以很容易地与其他成像方式相结合，如受激发射损耗（STED）和晶格光片显微镜，并发现有前景的生物医学应用。

来源：Single-Lens Light-Sheet Fluorescence Microscopy Based on Micro-Mirror Array Laser Photonics Reviews doi.org/10.1002/lpor.202100026

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