毛细管电泳检测方法（毛细管电泳相关技术）

毛细管电泳检测方法（毛细管电泳相关技术）5. 样品溶液和运行缓冲液不同，样品溶液中的溶剂必须能和运行缓冲液互溶，并不引起后者沉淀。另外，前者离子强度要低于后者离子强度。4. 温度也是影响进样体积的一个比较重要的因素，因为温度直接影响到黏度，当然这种影响不特别严重，因为样品区带只占整个体积的极小部分。1.毛细管一旦插入样品溶液，应立即开始进样操作，并在操作完成后迅速将其从样品槽移至运行缓冲液中，立即开始运行，否则将会产生毛细作用及虹吸现象，引起误差并使谱带展宽。2. 如果电极和毛细管接触，毛细作用可能导致进样时样品区带出现间断现象，使定量精度降低，区带展宽，甚至使峰分裂。另外，样品和缓冲液液面的高度不一致所产生的虹吸现象也会造成进样精度的下降。3. 只要检测器的灵敏性能提供足够的信号强度，进样区带越小越好，加大进样区带会使分离度降低。从这个意义上来说，进样时间以短为宜。但是，时间太短常会使精度差异，特别是在柱子较短、较粗或样品浓度

一、进样技术

大多数毛细管电泳系统具有自动加样的功能，能连续处理批量的标本。常用的自动加样方式有电动进样和气动进样。

（一）电动进样（电迁移进样）在这种进样方式下，毛细管的阳极端（假设电渗流朝接地段移动），先不与缓冲液接触，而直接置于样品溶液中。然后在很短时间内施加进样电压，使样品通过电迁移进入毛细管，在这种情况下，电迁移是溶质的电泳迁移和毛细管中的电渗流的综合效果。其装置简单，不需要附加设备，在介质黏度很高时使用更加有力。它还是凝胶电泳进样的唯一方式（因为在凝胶电泳中，压力进样困难并有可能把凝胶压出，使系统受到破坏）。

（二）气动进样（压差进样）气动进样是最常用的进样方法。具体做法有三种：即在进样端加压；在出口端加压；调节进样槽和出口槽之间的相对高度使之产生虹吸作用，将样品引入。进样时要注意以下几点：

1.毛细管一旦插入样品溶液，应立即开始进样操作，并在操作完成后迅速将其从样品槽移至运行缓冲液中，立即开始运行，否则将会产生毛细作用及虹吸现象，引起误差并使谱带展宽。

2. 如果电极和毛细管接触，毛细作用可能导致进样时样品区带出现间断现象，使定量精度降低，区带展宽，甚至使峰分裂。另外，样品和缓冲液液面的高度不一致所产生的虹吸现象也会造成进样精度的下降。

3. 只要检测器的灵敏性能提供足够的信号强度，进样区带越小越好，加大进样区带会使分离度降低。从这个意义上来说，进样时间以短为宜。但是，时间太短常会使精度差异，特别是在柱子较短、较粗或样品浓度较高时，更是如此。

4. 温度也是影响进样体积的一个比较重要的因素，因为温度直接影响到黏度，当然这种影响不特别严重，因为样品区带只占整个体积的极小部分。

5. 样品溶液和运行缓冲液不同，样品溶液中的溶剂必须能和运行缓冲液互溶，并不引起后者沉淀。另外，前者离子强度要低于后者离子强度。

6. 关于样品溶液和缓冲液的损耗和蒸发问题。毛细管和电极都相对较细，需要用合适的封闭装置，防止蒸发，通常宜测定蒸发的过程并根据运行时间的长短加以校正。除蒸发问题外，离子的电泳会使缓冲液从一个槽流到另一个槽中而造成损失。由于这个过程中水不断地电离，以使电中性得以保持，但最终会造成一个槽到另一个槽时离子无法保持平衡，而使其中的缓冲液pH改变。通常采用大体积的缓冲液或频繁地更换缓冲液来解决这一问题。

二、操作流程

毛细管电泳的基本操作流程包括清洗毛细管、更换电泳缓冲液、进样、电泳并同时在线检测等步骤。

1. 清洗毛细管 对于一根新的或久未使用的毛细管，需用1 mol /L的Na OH溶液、0.1 mol /L的Na OH溶液、超纯水依次清洗。在有些情况下还需用0.1 mol /L盐酸、甲醇或去垢剂清洗，强碱溶液可以清除吸附在毛细管内壁的油脂、蛋白质等，强酸溶液可以清除一些金属或金属离子，甲醇、去垢剂可去除疏水性强的杂质。在进行每次分析前，可用相当于毛细管总体积2~3倍的0.1 mol /L的Na OH溶液清洗一遍，一般为2~3 min，再用超纯水依次清洗后注入电泳缓冲液，以保证分析结果的重复性。

2. 更换电泳缓冲液 上一步清洗过程结束后，毛细管和电极从清洗液中移至电泳缓冲液，不可避免地将强碱或强酸等溶液带至其中。缓冲液本身也会因挥发、电泳等而改变其离子强度。因此，对于精确分析，每分析五次后需更换一次样品盘中的缓冲液。一般分析，半天更换一次即可。有些品牌的毛细管电泳仪具有自动更换电泳缓冲液的功能，即将进样盘中已用过的缓冲液排入废液瓶中，并从贮存瓶中引入新鲜的溶液。

3. 进样 进样方式有多种，每次进样量非常小。无论采用何种进样方式，毛细管插入样品溶液的深度一般要少于毛细管总长度的1%~2%。以尽量减少样品溶液经毛细吸附进入毛细管，从而影响进样量的精确性，样品管中溶液最少需5μl，进样体积为1~5pHnl，因此每次分析所耗的样品量只约为样品管中溶液的1/1000，样品可多次分析。经毛细管电泳后可再通过高效液相色谱法分离、序列测定等工作。

为防止样品挥发造成浓度改变，可对样品管加橡皮盖、盖子中间留有一缝隙，毛细管和电极可以自由出入。将样品盘连接至外围的冷却装置也可减少样品的挥发，并且还可保持蛋白质的活性。虽然绝大多数仪器进样时间可精确至0.1 s，但是由于毛细管在插入样品管时不可避免地会黏附一些溶液，进样时间过短会影响分析结果的重复性。通常进样时间可选择0.5~1 s，此时黏附的样品量相对于应吸入的体积可以忽略不计。

受毛细管内总体积的制约，对于浓度很稀的样品，毛细管电泳不能像高效液相色谱法那样可以加大进样量来提高检测灵敏度，但是可以来取一些措施得以改善。首先可以通过样品缓冲液和电泳缓冲液离子强度的不同来实现。当样品缓冲液的电导明显低于（100倍以上）电泳缓冲液的电导时，一旦在毛细管两端通上电压，可在样品区带前后形成一个更大的电场，使得样品溶液中的分子更快迁移。当这些分子趋向于到达电泳缓冲液边界时，这个附加产生的电场减弱，这些分子迁移减慢，直至样品移至电泳缓冲液边界，样品区带内电场均一。样品区带由宽变窄，样品中各成分得以浓缩。假如样品缓冲液和电极缓冲液的电导一样，而样品浓度较稀，不适合再进行稀释，可以在进样前先吸入一些水，也能达到浓缩的目的。无论采取何种进样方式，上述方法都可以使样品自动堆积浓缩。必须注意的是采取这种浓缩堆积方法时，由于在堆积区带电势陡降，会导致此区带温度升高。

4.在线检测 石英毛细管可以透过190~700nm范围内的光，在实验时应尽量选用低波长检测以提高灵敏度。与此相应地，电泳缓冲液必须在低波长下紫外吸收低，否则会增加基线噪声并降低检测信号。磷酸盐、硼酸盐等无机盐缓冲液符合上述条件，因而被广泛使用。若选用生物实验中常见的HEPES、CAPS、Tris等缓冲液时，则检测波长不得低于215 nm。与检测器相连的记录系统（记录仪、积分仪、电脑等），除可显示分离图谱外，还可以根据峰面积积分进行定量分析。但定量分析时要注意，不同的分子在毛细管电泳中的泳动速率不一致导致泳动慢的分子积分面积大，这可以将峰面积被除以迁移时间进行校正。

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