单克隆抗体制备中细胞融合方法（重组抗体在CHO细胞中的聚集及克服策略）

单克隆抗体制备中细胞融合方法（重组抗体在CHO细胞中的聚集及克服策略）HC与LC的比例失衡抗体聚集的机制常规单抗包括两个对称排列的抗原特异性结合(Fab)结构域和一个结晶(Fc)结构域，它们排列成为为含有两个重链(HC)和两个轻链(LC)的Y型结构糖蛋白(图1a)。每个LC由一个可变域(N-末端)和一个恒定域(C-末端)组成，每个HC由一个可变域和三个恒定域(CH1、CH2和CH3)组成。具有较大的流体动力学半径和表面积、非对称疏水性和电荷分布的抗体容易聚集。除了这些特征外，抗体由于其序列和结构还包含几个易于聚集的区域。例如，CDR包含疏水性残基和静电残基；在IgG1聚集体中经常发现分子间的β-折叠；mAb表面广泛的疏水斑块，特别是在Fc结构域上，易介导聚集。一般而言，抗体聚集可大致分为可溶或不可溶、共价或非共价、可逆或不可逆以及天然或变性。根据分子量，聚集体可分为六类：(1)能够快速可逆的非共价小寡聚物；(2)不可逆的非共价低聚物；(3)共价低聚物；(4)

利用基因工程制造重组抗体是生物制药工业的支柱。目前，近70%被批准上市的重组治疗性抗体是使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系生产的。CHO细胞最初是在1957年分离出来的，它们的持续培养和修饰导致了一些不同亚型的建立。与其他表达系统相比，CHO细胞表达系统具有以下几个优点：(1)CHO细胞产生与人类细胞相似的翻译后修饰(PTM)蛋白; (2)由于CHO细胞具有非人类来源，CHO细胞感染人类致病病毒的风险较低; (3)CHO细胞适合大规模无血清悬浮生产; (4)成纤维细胞和内源性蛋白很少分泌，有利于重组蛋白的分离和纯化; (5)目的基因可以容易和稳定地整合到CHO细胞的基因组中，具有高效的基因扩增和表达。

为了满足日益增长的对治疗性抗体的需求，已经开发了几种策略，如载体优化、培养基优化和细胞系工程，以提高产量。目前使用CHO细胞可以实现10g/L的抗体的产量，但保持产品高质量目前仍是一个挑战。例如，抗体聚集严重影响产品质量。产品中有10%的聚合物便可以诱导免疫反应，甚至可能导致死亡。在一些BsAb中聚集水平可以达到30%，甚至超过40%。

在这里，简要介绍下在CHO细胞工业化生产过程中影响抗体聚集形成的各种因素以及目前有效减少抗体聚集的策略。

重组抗体的结构和聚集体

常规单抗包括两个对称排列的抗原特异性结合(Fab)结构域和一个结晶(Fc)结构域，它们排列成为为含有两个重链(HC)和两个轻链(LC)的Y型结构糖蛋白(图1a)。每个LC由一个可变域(N-末端)和一个恒定域(C-末端)组成，每个HC由一个可变域和三个恒定域(CH1、CH2和CH3)组成。具有较大的流体动力学半径和表面积、非对称疏水性和电荷分布的抗体容易聚集。除了这些特征外，抗体由于其序列和结构还包含几个易于聚集的区域。例如，CDR包含疏水性残基和静电残基；在IgG1聚集体中经常发现分子间的β-折叠；mAb表面广泛的疏水斑块，特别是在Fc结构域上，易介导聚集。一般而言，抗体聚集可大致分为可溶或不可溶、共价或非共价、可逆或不可逆以及天然或变性。根据分子量，聚集体可分为六类：(1)能够快速可逆的非共价小寡聚物；(2)不可逆的非共价低聚物；(3)共价低聚物；(4)“大”聚集体，如果非共价则可能是可逆的；(5)“非常大的”聚集体(直径从50到3000纳米)，如果非共价则可能是可逆的；(6)不可逆的可见颗粒。

近年来，BsAbs显示出作为下一代治疗性抗体的巨大潜力，因为它们可以同时针对两个不同的抗原或同一抗原的两个不同表位。有两种常见的BsAbs，即基于单链可变区(ScFv)的抗体(不含Fc段)和全长类Ig G不对称抗体。制造不对称的BsAbs的主要挑战之一是不正确的组装。与单抗不同，全长类不对称BsAbs包含两个不同的LC和HC(图1b)。在不同的HC和LC随机组装后可能产生16个组合和10个不同的分子构型，导致链失配和同源或异源聚集的可能性很高(图1c)。两个不同的HC之间或LC和HC之间的不匹配可能会导致聚集。此外，BsAb生产的其他副产物，如同源二聚体、缺少LC的抗体、HC聚合物以及游离的HC和LC，也可能形成聚集体。

图1. 抗体结构示意图

抗体聚集的机制

HC与LC的比例失衡

根据抗体组装的动力学，LC和HC的等量表达不是最佳比例。抗体组装的数学模型表明，组装时间与LC和HC的相对量呈负相关。研究证明，LC在正确组装抗体方面发挥着重要作用，并且LC表达水平越高，细胞活力越高，产量越高，聚集率越低。过多的LC可以使mAb折叠和组装更有效。有研究发现LC/HC的mRNA比率低于1.5可以导致形成高水平的聚集体。因此，LC/HC的适当比例是影响质量的重要因素。

为了在CHO细胞中表达单抗，已经开发了不同的载体设计策略。在CHO细胞中，通过在不同的载体中或在同一载体中的多启动子系统的控制下，将LC和HC基因共转染，可以实现mAbs的表达。携带HC或LC基因的单独质粒的共转染受到转染效率和整合部位位置的负面影响。有研究比较了单启动子、双启动子和多启动子载体，发现双启动子载体获得了最高的表达。当不同的启动子驱动HC和LC基因时，由于邻近的多个启动子引起的转录干扰，会影响LC和HC的比率。同样，多顺反子载体也面临着同样的挑战。例如，当内部核糖体进入位点(IRES)元件被放置在两个基因之间时，IRES下游的基因表现出较低的表达。

胞内环境

细胞内环境的氧化还原状态可以影响蛋白质折叠过程中二硫键的形成，并影响内质网(ER)中不匹配的二硫键的还原和再氧化。未折叠或错误折叠的蛋白质可以通过内质网相关降解(ERAD)途径消除。错误折叠的蛋白质在细胞内的积累会损害内质网功能并触发未折叠蛋白反应(UPR)，可能会引发内质网应激反应。UPR信号级联也可以导致HC结合蛋白(BIP)的催化活性上调和激活，从而进一步促进氧化折叠和增加错配的二硫键的形成，最终导致聚集。灌流培养可用于减轻CHO细胞中线粒体功能障碍引起的谷胱甘肽氧化和内质网应激，从而降低抗体聚集水平。

细胞培养条件对聚集的影响

温度是影响细胞生长和抗体产量的重要细胞培养参数。对于大多数蛋白质来说，温度的升高将增加部分未折叠蛋白质的比例，并加快扩散和碰撞的速度，从而加速聚集的形成。当然，对于抗体来说也是如此。然而，降低温度会导致某些单抗在CHO细胞中聚集的增加。

pH也可以影响许多细胞过程，包括细胞生长和代谢、蛋白质构象和胶体稳定性、聚集形成和聚集溶解性。在抗体制造过程中，抗体的酸处理可引发它们的聚集。酸性条件可诱导单抗变性和聚集。即使是瞬间暴露在酸性条件下，也会加速聚集体的形成。在低pH条件下，某些化学修饰对治疗性抗体的影响可能发生改变。例如，蛋氨酸氧化修饰对抗体聚集几乎没有影响，但它们的影响在低pH时加剧。

克服重组抗体聚集的策略

LC或HC的设计可防止错配

虽然抗体聚集的机制还不完全清楚，但热力学聚集势可以从抗体序列和结构的内在特征中推断出来。因此，通过修改序列和结构可以显著减少聚集是合乎逻辑的。基于单抗聚集的不同阶段，一些改善聚集的方法包括(1)稳定天然单体或破坏部分折叠单体的稳定；(2)改变部分折叠蛋白质的表面电荷以增加它们之间的排斥力；(3)抑制未折叠单体的结构重排，以防止疏水接触和β-折叠的积累。例如，通过将轻链CDR2(Cys49)附近的游离半胱氨酸残基突变为苏氨酸或天冬氨酸，降低了Ang2单抗的聚集。

对于BsAbs，近年来已经开发了几种技术来帮助防止两种不同HC的异二聚化和区分两种不同的LC和HC相互作用。这些技术包括(1) TcBsIgG技术，它通过G4S连接子将LC的可变区连接到HC；(2)LUZ-Y平台，它涉及在CH3结构域的C末端增加亮氨酸zipper；(3)单臂单链Fab异源二聚体双特异性IgG (OAscFab-IgG)技术，其中一个HC由单链Fab组成，以防止LC配对错误；(4)Fab×单域抗体(Fab×sdAbFc)，它将Fab与单域抗体结合；(5)通过CH3的DEKK突变进行的静电修饰，这涉及到引入带电残基以防止IgG同源二聚化。这些技术可以有效地减少抗体错配，最大限度地减少聚集，从而提高抗体质量。

表达载体的分子设计

设计和优化抗体表达载体可以提高抗体的产量，维持治疗性抗体的水平表达。由于单顺反子和多启动子表达载体的局限性，多顺式表达系统被广泛应用。目前自裂解的2A多肽(F2A)或IRES经常用于三顺反子载体。IRES驱动的帽非依赖性翻译效率低于帽依赖翻译效率，因此LC作为第一顺反子可以有更高的mAb表达和更少的聚集。由F2A驱动的三顺反子载体也显示出类似的结果。

分子伴侣辅助蛋白质折叠

分子伴侣是一种高度保守的蛋白质，存在于细菌和真核细胞的细胞质和细胞器中，可以促进蛋白质的正确折叠，而不是最终结构的一部分。因此，分子伴侣可能通过帮助蛋白质折叠来帮助防止聚集。例如有报道HSP90B1和DDIT3 分子伴侣可以减少BsAb聚集体的形成。

通过加入培养基添加剂减少聚集

在细胞培养液中加入非营养性化学添加剂常被用来提高治疗性抗体的表达。海藻糖是一种非还原糖，具有化学伴侣的作用，被用作商业治疗性抗体抗聚集保护剂，如Herceptin®、Avestin®、Lucentis®和Advate等。研究发现海藻糖可以使BsAbs中的高分子量聚集物降低三分之二。同样，丁酸钠可以减少单抗的聚集。

氨基酸作为培养上清液的主要成分，对抗体的质量属性有重要影响。在CHO细胞的补料分批培养中，酪氨酸是维持mAbs效价和质量属性的关键，降低酪氨酸水平会一定程度的减少聚集。

改变培养过程参数

改变培养过程的不同参数可以显着减少抗体聚集。例如，将细胞培养温度降低至31℃，将培养基的osmolality调节至420 mOsmol/kg，以100 rpm搅拌细胞，并使用0.04%（w/v）止泡剂可显着降低抗体的聚集水平。对于BsAb产生，灌注培养可用于减少由线粒体功能障碍诱导的谷胱甘肽氧化和ER应激，这导致有利的细胞内环境以减少抗体聚集。

小编小结

在过去的几年里，使用CHO细胞生产抗体取得了很大的进展。在抗体产品质量属性中，抗体的聚集尤其令人担忧，因为它们可以在人类体内触发人类免疫反应，并可能是致命的。因此最小化抗体在CHO细胞中的聚集具有重要意义。目前已经使用几种策略来减少抗体聚集，包括修饰抗体一级结构，优化表达载体，过表达分子伴侣，以及优化培养参数等(图2)。

图2. 抗体组装的过程及主要影响因素

参考文献

1.Recombinant antibodies aggregation and overcoming strategies in CHO cells.

2.Prediction and reduction of the aggregation of monoclonal antibodies.

3.Trehalose suppresses antibody aggregation during the culture of Chinese hamster ovary cells.