高纯度s-乙酰l-谷胱甘肽生产企业（酶-化学级联催化高效生产L-高苯丙氨酸）

高纯度s-乙酰l-谷胱甘肽生产企业（酶-化学级联催化高效生产L-高苯丙氨酸）在PpNahE全细胞催化反应的质谱图中也发现了(2)的特征峰。表明大肠杆菌中含有一种能将(3)转化为(2)的ER。为验证这一点，不表达任何酶的大肠杆菌细胞分别与10 mM的(3)和20 mM的NADH孵育。反应1 h后，用HPLC检测到(2)，产率为99%(图2B)，表明大肠杆菌含有高活性的ER。基于受体，作者选择了苯甲醛类醛和9种丙酮酸依赖的醛缩酶来催化(6)和(5)的羟醛反应。这些醛缩酶在大肠杆菌中过表达，将获得的重组大肠杆菌菌株作为全细胞催化剂将(6)(50 mM)和(5)(50 mM)转化为(4)。化合物(3)经高效液相色谱(HPLC)(图2A)和质谱仪(MS)检测，化合物(4)可自发转化为(3)。结果表明，PpNahE和SaKDG的产率分别为94.1%和96.4%。而PpNahE的时空产率(STY)为4.21 g/L/h，远高于SAKDG的0.36 g/L/h。因此，PpNahE

今天推送的文章发表在Angew.Chem.Int.Ed.上的“Efficient Production of L-homophenylalanine by Enzymatic–Chemical Cascade Catalysis”，作者为江南大学生物工程学院的刘立明教授。

L-高苯丙氨酸(L-HPA)是一种具有代表性的非天然氨基酸，是许多手性药物的重要组成部分，包括血管紧张素转换酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、中性内肽酶抑制剂和β-内酰胺类抗生素。因此，开发了几种化学和酶合成方法，提供了足够的L-HPA来满足市场需求。L-HPA的化学生产主要使用受保护的底物，如N-邻苯二甲酰基-L-天冬氨酸(三步，产率82%)、N-苄氧甲酰-L-天冬氨酸(三步，产率13%)和1-氯-3-苯丙烷(六步，产率75%)。然而，由于加工成本高、环境污染、操作步骤繁琐、产率低等因素，这些底物的可用性受到限制。酶法合成需要温和的反应条件和良好的选择性，促进了“绿色化学”的概念。目前，酶法合成L-HPA主要使用高苯丙氨酰海因、3(R，S)-苄基-L-天冬氨酸或2-氧-4-苯基丁酸(OPBA)作为底物，这种方法的限制因素是OPBA底物的高昂价格，使其无法用于工业生产目的。因此，必须开发一条高效、经济的生产L-HPA的合成路线。

目前，级联催化可以从简单的起始原料一锅合成目标分子。然而，在级联催化中，要实现目标化合物的高效生产，通常必须解决三个问题：路线设计、酶筛选和酶组装。首先，关于如何设计级联路线来合成目标化学品，通常使用逆合成分析(如生物合成或反生物合成)。计算平台，如RetroPath2.0和RetroBioCat来指导逆合成和简化设计过程。已经开发许多有效的酶筛选方法，包括文献挖掘、基因组挖掘、酶文库筛选和酶发现。在选择酶时，应特别注意酶反应条件的兼容性，因为来自不同生物体的酶需要不同的最适pH和温度条件，并在有机溶剂耐受性和酶稳定性方面表现出不同的性质。在一锅中组装酶，特别是在一个细胞中组装酶，应该可以解决酶活性比率失衡的关键问题。这个问题可以通过酶表达调控策略来解决，例如启动子替换、RBS调控、多质粒系统、基因拷贝修饰和蛋白质工程。通过优化反应条件，可以从廉价的原料分子中高效地生产目标化合物。

在本研究中，作者设计了一种酶-自发化学级联生产L-HPA的路线。这种级联生物催化以全细胞方式运行，使用容易获得的苯甲醛和丙酮酸作为底物。为了在大肠杆菌中实现平衡的酶比例，以促进L-HPA的生产，通过蛋白质工程提高了限速酶TipheDH的催化效率和表达水平。最终得到了平衡良好的酶级联路线，并高效地生产了L-HPA。

对L-HPA进行了逆合成分析，结果表明，L-HPA(C10)通过C-C键的异位或同位断裂和官能团的相互转化，被断开为C8 C2、C7 C3和C6 C4的组合(图1A)。在作者之前的研究中，使用C8 C2的组合(苯乙醛和甘氨酸)合成了L-HPA。但产率低，且C8底物(苯乙醛)不易获得。由于C6结构的稳定性，C6和C4构建块不容易通过酶反应组装。因此，作者选择了C7 C3的组合来设计生产L-HPA的合成路线。

级联路由是在RetroBioCat(https://retrobiocat.com/))中使用网络资源管理器模式设计的(图1B)。以游离氨为氨基供体，2-氧代-4-苯基丁酸(2)在苯丙氨酸脱氢酶(PheDHs)作用下可合成L-HPA(1)。(E)-2-氧代-4-苯基-3-烯酸(3)可通过烯还原酶催化烯还原合成(2)。为了实现从经济的原料合成L-HPA的目标，对这条路线进行了进一步的人工优化(图1C)。由于^αC-H相对较高的活性水平，4-羟基2-氧代-4-苯基丁酸(4)可以通过自发脱水反应生成(3)。(3)的相对吉布斯能(-8.69 kcal mol^-1)低于(4)的相对吉布斯能(0 kcal mol^-1)，表明(4)可以自发转化为(3)。进行了从(4)到(3)的密度泛函理论(DFT)计算。如图1D所示，在中性条件下，(4)在C-OH中通过断键过程形成中间体，然后经过额外的脱氢最终形成(3)。最后，以廉价的C7和C3苯甲醛(6)和丙酮酸(5)为原料，通过醛缩酶催化的羟醛缩合反应合成了(4)。

因此，在本研究中，基于逆合成分析设计了一条酶-化学级联路线，如下(图1E)：(Ⅰ)(6)和(5)在醛缩酶的作用下转化为(4)；(Ⅱ)(4)自发脱水为(3)；(Ⅲ)(3)通过烯还原酶(ER)转化为(2)，NADH为辅因子；(Ⅳ)(2)通过苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)转化为(1)，NADH为辅因子，游离氨为氨基供体。为了提供足够的NADH辅因子，采用了以甲酸脱氢酶(EC 1.17.1.9)为基础的NADH再生系统。在这个级联反应中，引入了自发的化学脱水反应，将醛缩酶催化的C-C键的形成与ER催化的C=C还原联系起来。在本研究中，自发脱水反应是生物相容的，不需要添加在温和条件下(如细胞内环境)可以自发反应的化学催化剂。

基于受体，作者选择了苯甲醛类醛和9种丙酮酸依赖的醛缩酶来催化(6)和(5)的羟醛反应。这些醛缩酶在大肠杆菌中过表达，将获得的重组大肠杆菌菌株作为全细胞催化剂将(6)(50 mM)和(5)(50 mM)转化为(4)。化合物(3)经高效液相色谱(HPLC)(图2A)和质谱仪(MS)检测，化合物(4)可自发转化为(3)。结果表明，PpNahE和SaKDG的产率分别为94.1%和96.4%。而PpNahE的时空产率(STY)为4.21 g/L/h，远高于SAKDG的0.36 g/L/h。因此，PpNahE被选为该级联反应的第一步。

在PpNahE全细胞催化反应的质谱图中也发现了(2)的特征峰。表明大肠杆菌中含有一种能将(3)转化为(2)的ER。为验证这一点，不表达任何酶的大肠杆菌细胞分别与10 mM的(3)和20 mM的NADH孵育。反应1 h后，用HPLC检测到(2)，产率为99%(图2B)，表明大肠杆菌含有高活性的ER。

采用基因组挖掘策略确定大肠杆菌中的目标ER(图2C)。从NtDBR(属于中链脱氢酶/还原酶类[MDR])、YqjM(属于旧黄色酶类[OYE])和CAER(属于氧敏感的烯酸还原酶类[EnoR])三类能够催化类似(3)底物的ER被选为探针。利用所选择的探针，在大肠杆菌基因组中筛选出了苯醌氧化还原酶(EcQOR)、依赖NADPH的姜黄素/二氢姜黄素还原酶(EcCurA)和2，4-二烯酰辅酶A还原酶(EcDCR)。这些酶被过表达和纯化以与(3)孵育以产生(2)，其中EcQOR的得率最高(99%)(图2D)。EcQOR(类zetacrystallin蛋白)通常会减少对苯二酚。在本研究中，EcQOR被发现能够还原(3)(不饱和芳香酮酸类)(图2e)。

通过文献挖掘筛选出苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，将(2)转化为(1)。筛选了三种高催化效率的PheDH，并进行了过表达和纯化，以将(2)转化为(1)。Thermoactinomyces intermedius的TipheDH对(2)有很好的催化性能(用HPLC法测定，产率＞99%，对映体过量[ee]＞99%)。最常用的NADH再生系统，甲酸脱氢酶(来源于假丝酵母，CbFDH)，由于其廉价的辅助底物和高活性而被选中。

为在体外验证所设计的级联反应的可行性，使用纯化的酶(TipheDH、PpNahE、EcQOR和CbFDH，摩尔比为1：1：1：1)转化5 mM的(6)和(5)以生成(1)。化合物(1)合成成功，但转化率仅为65%，STY为0.55 g/L/h，反应过程曲线显示有大量的中间产物(2)积累(图3A)。为确定限制步骤，作者计算了反应条件(pH 8.0)下(4)到(3)的DFT，能垒为7.01 kcal mol^-1(低于中性条件下的10.65 kcal mol^-1)，表明反应条件(pH 8.0)更有利于该反应。然后检测了级联酶的动力学参数(表1)。TipheDH的比活力仅为3.0 U/mg，远低于PpNahE(12.5 U/mg)、EcQOR(8.9 U/mg)和CbFDH(7.6 U/mg)。在不同的级联酶活比下进行反应，当PpNahE/EcQOR/TipheDH/CbFDH的最佳比例为1.5：1：1：1.52.5(图3B)时，(1)的产率最高(95%)，产率最高(1.29 g/L/h)。

为了在大肠杆菌菌株中组装级联酶，从4个不同拷贝数的质粒中获得了12株重组菌株(W1-W12)，其中菌株W11的转化率最高，为51.5%。然而，级联酶的比例为2.1：1.2：0.2：1.9，导致(2)作为中间体积累(42%)(图4A，表2)。与最适的体外活性比相比，TipheDH的体内活性明显不足。此外，SDS-PAGE分析表明，TipheDH的表达水平远低于其他三种酶(图4B)。

为了设计TipheDH以提高其催化效率，使用AlphaFold2构建了TipheDH的能量最小化结构模型。然后使用所获得的模型与底物(2)进行对接分析以生成对接模型。根据对接模型和与红球菌RspheDH的结构比对，鉴定了催化残基(包括G43、K69、K81和D116)(图5A)。丙氨酸扫描进一步证实这些残基被灭活(图5B)，由于相邻催化残基的协同作用，9个邻近的非保守残基(图5C)被选为潜在的热点。将半饱和突变结合高通量筛选策略用于蛋白质工程，获得了两个单突变体TipheDH^C70A和TipheDH^T115E，比活分别提高了1.45倍和1.32倍；然后将这些组合得到双突变体TipheDH^C70A/T115E，其活性比野生型(WT)提高1.82倍(图5D)。突变株TipheDH^C70A/T115E随后被菌株W11中的WT替换，得到菌株W13，其活性比为2：1：0.3：1.8，L-HPA效价为2.6 g/L，转化率为72.1%(表2)。

为了增加TiPheDH^C70A/T115E的表达水平，对TiPheDH^C70A/T115E中的五个表面暴露的和非保守的Cys残基进行定点突变（图5E）；获得两个有益突变TipheDH^{C70A//T115E/C256A}和TipheDH^{C70A//T115E/C282L}，然后组合产生四重突变体TipheDH^{C70A//T115E/C256A/C282L}。TipheDH^{C70A//T115E/C256A/C282L}的蛋白质表达水平增加2.77倍（图5G）。此外，作者在TipheDH的C末端（12个残基）检测到无序区域（图5E），其在每三个残基处被截断。在四种截短的酶中（图5F），最佳突变体（r360TipheDH^{C70A//T115E/C256A/C282L}）表现出3.54倍的表达水平增加（图5G）。相对于TipheDH^C70A//T115E，r360TipheDH^{C70A//T115E/C256A/C282L}的比活没有显着变化（图5G）。该结果表明细胞内酶活性的增加确实是由于酶表达水平的增加，这也通过SDS-PAGE分析证实。最后，用TipheDH^C70A//T115E替换r360TipheDH^{C70A//T115E/C256A/C282L}以产生菌株W14。该菌株显示出与体外相似的活性比（1.7:1.1:1:1.8），产生3.4 g/L（1）（95.3%转化率）和5.1 g/L/h STY（表2）。

为了进一步提高(1)的生产效率，用菌株W14作为全细胞催化剂对反应条件进行了优化。在最佳条件下(pH 8.0，30 ℃，25 g/L湿菌种，0.2 mM NAD )，L-HPA的转化率达到95.3%，STY为5.79 g/L/h。然而，甲醛等醛即使在低浓度时也会导致酶变性，当苯甲醛浓度超过50 mM时，酶活性急剧下降。因此，在5 L反应器中采用补料分批策略进行了制备性生物转化实验(图6A、6B)。(6)和(5)分12批共加入600 mM(每批50 mM)，18 h得到100.9 g/L的L-HPA(转化率94%，STY为5.61 g/L/h)。随着反应的进行，反应体系中产生了白色的沉淀物，这是由于产物(1)的低水溶性造成的。因此，(1)可以通过简单的离心和重结晶容易地分离出来，纯度为98%，分离得率为82%。对映体产物的核磁共振波谱表明其结构正确。苯甲醛和丙酮酸的成本比直接使用OPBA低约17.4倍。与化学合成相比，由于需要受保护的底物，保护和解除保护过程具有成本方面的特殊缺点。因此，本研究提出了一种在绿色经济的工业环境中生产L-HPA的有前景的方法。

整理：孙骁

文章信息：

DOI：10.1002/anie.202207077

文章链接：https://doi.org/10.1002/anie.202207077