检测靶分子是蛋白质的技术（标签蛋白ProteinTag）

检测靶分子是蛋白质的技术（标签蛋白ProteinTag）其原理是抗原—抗体反应，这些标签抗体可以高度特异地结合对应的标签融合蛋白。标签抗体是开展基因蛋白表达、信号转导和基因功能研究的常用工具。标签蛋白抗体是一类经过亲和纯化的小鼠单克隆抗体。用于检测各种商品化表达载体上的标签序列（如：MyC、His、GST、HA等），籍以分析检测目的蛋白的表达含量及其功能。Western bloting（蛋白质印迹法）→Flag标签；免疫共沉淀→Flag、HA或cMyc标签；另一类为自发荧光标签，它们主要应用于目的蛋白表达代谢的动态监测，较为常用的为荧光素酶报告基因系统（上期已介绍）和荧光蛋白家族。

标签蛋白(Protein Tag)和标签蛋白抗体

标签蛋白是与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。

主要分为两类，一类为将目的蛋白质分离纯化(留存下来)的亲和吸附标签。

蛋白纯化→His标签；

Western bloting（蛋白质印迹法）→Flag标签；

免疫共沉淀→Flag、HA或cMyc标签；

另一类为自发荧光标签，它们主要应用于目的蛋白表达代谢的动态监测，较为常用的为荧光素酶报告基因系统（上期已介绍）和荧光蛋白家族。

标签蛋白抗体是一类经过亲和纯化的小鼠单克隆抗体。用于检测各种商品化表达载体上的标签序列（如：MyC、His、GST、HA等），籍以分析检测目的蛋白的表达含量及其功能。

其原理是抗原—抗体反应，这些标签抗体可以高度特异地结合对应的标签融合蛋白。标签抗体是开展基因蛋白表达、信号转导和基因功能研究的常用工具。

一、亲和吸附标签

亲和标签是重组蛋白纯化的一个重要且有效的工具，它们不仅便于对融合蛋白进行检测与纯化，而且可能对目标蛋白的理化性质产生有利的影响，包括提高重组蛋白的产量、增强重组蛋白的可溶性以及促进重组蛋白的正确折叠等。较为常用的几种标签为6*His(6个组氨酸)、Flag、HA、c-Myc和GST标签。

20种氨基酸名称和英文缩写：

丙氨酸（Ala-A）、缬氨酸（Val-V）、亮氨酸（Leu-L）、异亮氨酸（ile-I）、

脯氨酸（Pro-P）、甘氨酸（Gly-G）、蛋(甲硫)氨酸（Met-M）、色氨酸（Trp-W）、

苯丙氨酸（Phe-F）、谷氨酰胺（Gln-Q）、丝氨酸（Ser-S）、苏氨酸（Thr-T）、

半胱氨酸（Cys-C）、天冬酰胺（Asn-N）、酪氨酸（Tyr-Y）、天冬氨酸（Asp-D）、

谷氨酸（Glu-E）、赖氨酸（Lys-K）、精氨酸（Arg-A）、组氨酸（His-H）

① 根据实验目的选择合适的标签；

② 确定标签蛋白对目的蛋白的表达是否产生干扰；

③ 确定标签蛋白标记的位置是在目的蛋白的N端还是C端。

6*His：

6*His是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。其作为标签，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。

使用His-tag有下面特点：

1.标签的分子量小，只有~0.84KD，一般不影响目标蛋白的功能；

2.His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性；

3.His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；

4.His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体；

5.可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；

6.可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

Flag

Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），是第一个为用于融合蛋白而设计的表位标签，并且是唯一一个申请专利的标签。标签中多个带负电的氨基酸不太可能影响靶蛋白活性。带有FLAG标签的蛋白可以用特定的抗体M1、M3、M5来识别或回收。FLAG一直被用于细菌、酵母和哺乳动物细胞中。3X FLAG可以改善FLAG标签的检测。

FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下特点：

1.FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究；

2.融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高；

3.FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过WesternBlot等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定；

4.融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。

HA

HA标签蛋白，标签序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，9个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小 容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti－HA抗体检测和ELISA检测。

c-Myc

C-Myc标签蛋白，Myc标签包含了人类原癌基因Myc中拥有10个氨基酸的片段（EQKLISEEDL）这10个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。由于有高特异性的抗Myc单克隆抗体，它被广泛用于检测体系。它很少用于纯化。Myc标签一直被用于蛋白质印迹、免疫荧光和免疫沉淀实验。

V5

V5表位标签，GKPIPNPLLGLDST，来自于副黏液病毒P/V蛋白。副黏液病毒，一种反义RNA病毒，会导致一些常见的人类疾病，诸如腮腺炎，麻疹，支气管炎，肺炎和哮吼。哺乳动物和昆虫表达体系通常会用到V5标签。虽然它也用于蛋白质纯化，该标签对于蛋白质检测往往是很有用的，诸如在蛋白质印迹、免疫荧光和免疫沉淀实验中。

Avi Tag

AviTag标签蛋白是一个15个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端。融合表达后，可被生物素连接酶生物素化，为了纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白质分离纯化，还用于蛋白质相互作用研究。

Avi Tag标签系统具有以下几大特点:

1.无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的AviTag位点轻易且有效地被生物素化；

2.生物素化是通过酶和底物的反应来实现，反应条件相当温和而且标记的专一性极高；

3.生物素AviTag只有15个氨基酸，对蛋白空间结构的影响非常小。

GST

GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。主要应用在原核表达中，将其应用在原核表达的原因大致有两个，一个是因为它是一个高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。

GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM还原型谷胱甘肽洗脱。在大多数情况下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二体。

GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。

纯化：该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathionesepharose)亲和树脂进行纯化。GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如：盐酸胍或尿素等。

如果要去除GST融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。

检测：可用GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。

SUMO

SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白（
Smallubiquitin-likemodifier），是泛素(ubiquitin)类多肽链超家族的重要成员之一。在一级结构上，SUMO与泛素只有18%的同源性，然而两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。研究发现SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。

此外SUMO还有一项重要的应用，就是可用于完整地切除标签蛋白，得到天然蛋白。因为SUMO蛋白水解酶能识别完整的SUMO标签蛋白序列，并能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来。切除SUMO后，经过亲和层析，去除标签蛋白部分，就得到和天然蛋白一样的重组蛋白。所以SUMO标签也常用于和其他标签一起应用，作为特异酶切水解位点。

Halo Tag

Halo Tag标签蛋白是一种脱卤素酶的遗传修饰衍生物，可与多种合成的Halo Tag配基有效地共价结合。这个分子量为33KDa的单体蛋白能融合在重组蛋白的N端或C端，并在原核和真核系统中表达。

HaloTag配基是小分子化学物，能够在体外或体内与Halo Tag蛋白共价结合。这些配基由两个关键组分组成：(1)一个是通用的Halo Tag反应联结子，结合Halo Tag蛋白；(2)一个是功能基团 例如荧光染料或亲和媒介。

能够共价和特异性结合多种合成的报告基团和亲和配基的特性，使得Halo Tag蛋白能够用于检测和亲和结合或固相化固定目的蛋白。

SNAP-Tag

SNAP-Tag是新一代的蛋白标签技术，不仅专一性极高而且稳定，最大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相(如SDS-PAGEgels)等。

SNAP-Tag是从人烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶获得。无论体内还是体外，SNAP-Tag都能与底物高特异性地共价结合，使蛋白标记上生物素或荧光基团（如荧光素和若丹明）。

SNAP所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团，释放出了鸟嘌呤。这种新的硫醚键共价结合使SNAP所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物。苯甲基鸟嘌呤在生化条件下稳定，并且没有其他蛋白会和这类物质作用，所以SNAP标签反应是高特异的。

检测：生物素或各种颜色荧光的底物（如荧光素、若丹明）可渗透进入细胞，方便快捷地进行活细胞内SNAP-Tag融合蛋白的标记与检测。它们也可特异性地标记大肠杆菌，酵母和哺乳动物等细胞抽体液或已经纯化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。

将纯化的或未纯化的SNAP-Tag融合蛋白与表面固定了苯甲基鸟嘌呤的基质混合，蛋白即可特异与底物作用，形成共价键，融合蛋白间接被固定在了基质表面上，可以达到更方便快捷地研究蛋白功能或纯化蛋白的目的。

MBP

MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。

纯化：融合蛋白可通过交联淀粉亲和层进一步纯化。结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。一些融合蛋白在0.2%Triton X-100或0.25%Tween 20存在下不能有效结合，而其他融合蛋白则不受影响。缓冲条件为pH7.0到8.5，盐浓度可高达1M，但不能使用变性剂。如果要去除MBP融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。

检测：可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。

二、荧光蛋白

荧光蛋白发光团无物种专一性，且不依靠任何介质发光，所以转入宿主细胞的荧光蛋白基因表达很稳定，并对大多数宿主细胞无影响，能显示单个或多个基因的表达情况。此外，在细胞转染实验中，载体上带有一个荧光蛋白可以很清晰、直观地观察细胞的转染效率。

eGFP/eCFP/eYFP/mCherry

分别是增强型绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/单体红色荧光蛋白 具有不同的激发波长发射波长为，均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变和密码子优化而来，更通俗的说法应该是报告基因。

就eGFP而言，相对于GFP，其荧光强度更强、荧光性质更稳定。同时载体中构建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。mCherry是从DsRed演化来的性能最好的一个单体红色荧光蛋白，可以和GFP系列荧光蛋白共用，实现多色标记体内、外实验表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白时，荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能相互没有明显影响。

这些荧光标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下特点：

1.不用破碎组织细胞和不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针；

2.其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况；

3.同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测更显得快速、简便、灵敏度高而且重现性高；

4.其低消耗、高灵敏度检测，十分适用于高通量的药物筛选。因此现eGFP表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。

5.mCherry红色荧光蛋白在标记病毒颗粒，研究病毒和宿主细胞之间更有得天独厚的优势。如用mRFP或mCherry标记HIV病毒颗粒，研究HIV和宿主细胞间的相互作用以及HIV侵染宿主细胞的过程．用mRFP标记慢病毒颗粒，研究慢病毒在小鼠体内的复制过程等。

标签抗体，别名为抗原表位，又称抗原决定簇，是抗原分子中决定抗原特异性的特殊区域或基团，是与抗体特异性结合的结构或序列。随着生物技术的发展，科研人员可以通过DNA重组技术，构建包含目的基因以及表位标记的融合蛋白，进而通过特异性标签抗体对其鉴定与纯化，以达到研究的需求。常用的标签包括myc、HA、Flag、His、GST等。

1. Flag标签—抗Flag标签抗体

Flag标签系统是利用一个短的亲水性八氨基酸肽(DYKDDDDK)融合到目标蛋白。Flag标签可位于蛋白质的C端或N端，该系统已广泛应用于各种细胞类型，包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等，相应的Flag标签抗体也被广泛应用。由于Flag标签系统的纯化条件是非变性的，因此可以纯化所有有活性的融合蛋白。Flag标签可以通过加入肠激酶处理去除，肠激酶专一识别该肽序列C末端的5个氨基酸残基。Flag抗体可以用于检测和Flag标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测Flag融合表达蛋白等。

2.His标签—抗His标签抗体

His标签是由6个组氨酸(His-His-His-His-His-His)组成的短肽 专门设计用于重组蛋白质的吸附纯化。由于分子量较小，并且较容易分离和纯化，His融合标签与其他标签相比有很多明显优势，是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种。利用 His标签可以建立一个基于融合蛋白的高效检测和纯化系统。His抗体可以用于检测和His标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测His融合表达蛋白等。

3. GST标签—抗GST标签抗体

GST标签体系具有蛋白表达产率高、表达产物纯化方便，以及利于GST抗体制备等特点。GST融合蛋白在水溶液中可溶，可从细菌裂解液中提取，在不变性的条件下通过亲和层析得到。GST融合蛋白可被位点特异性蛋白酶裂解，从而除去GST蛋白。融合蛋白又是一个非常好的强免疫原，因此，很容易制备抗新蛋白的抗体。正是由于以上的优点，商品化的GST融合蛋白表达体系以及GST标签抗体系统至今仍被广泛应用。近年来在原核表达体系中，谷胱甘肽S转移酶GST表达纯化系统的应用更为普遍。

4. Myc标签—抗Myc标签抗体

Myc标签(序列为:EQKLISEEDL)在WB杂交技术、免疫沉淀IP和流式细胞术中均得到成功运用，可用于检测重组蛋白在细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳细胞中的表达情况。Myc重组蛋白质可通过偶联Myc标签抗体到二乙烯砜活化的琼脂糖上而进行亲和纯化。Myc标签可放在C端或N端，但Myc重组蛋白的低pH洗脱条件往往会降低蛋白质的活力，因此Myc标签系统广泛应用于检测但很少用于纯化。

5. HA标签—抗HA标签抗体

HA标签来源于人类流感血凝素的98-106位氨基酸，利用一个HA (influenza hemagglutinin epitope: YPYDVPDYA)短肽融合到目标蛋白。HA标签具很强的免疫反应性，被广泛用于HA融合目的蛋白的分离、纯化、检测和示踪。重组的HA标签蛋白可以使用偶联有HA高特异性单克隆抗体的树脂来完成高效纯化。HA标签系统HA标签可位于蛋白质的C端或N端，该系统已广泛应用于多种细胞类型，相应的HA标签抗体也被广泛应用，HA标签抗体能特异识别C末端或N末端带有HA标签(HA-tagged)的融合蛋白。

6. GFP标签—抗GFP标签抗体

绿色萤光蛋白(Green Fluorescent Protein)，简称GFP，在蓝色波长范围的光线激发下会发出绿色萤光。GFP或其突变体EGFP等被广泛用于基因表达效率的检测，以及和目的蛋白融合表达用于检测目的蛋白的表达和分布。一般来说，GFP抗体不仅可以检测GFP或其适当的突变体，也可以检测和GFP或其适当的突变体融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测GFP融合表达蛋白等。