EGFR酪氨酸激酶抑制剂（比较表EGCG和GCG对酪氨酸酶抑制能力及与曲酸联合抑制效应）

EGFR酪氨酸激酶抑制剂（比较表EGCG和GCG对酪氨酸酶抑制能力及与曲酸联合抑制效应）酪氨酸酶（tyrosinase，TY）是黑色素产生的关键酶，在控制食物褐变和色素沉着性皮肤病中发挥重要作用。当TY过量存在或其活性过高时，黑色素可能会过度表达和聚集，从而导致皮肤疾病、食物褐变和虾黑变病等。抑制TY的催化活性，阻止酪氨酸氧化为黑色素并减少黑色素的产生已成为预防和黑色素沉着性皮肤病和控制食品酶促褐变的主要途径。茶是世界著名的三大饮料之一，在国外享有“健康之液，灵魂之饮”的美名，在我国被誉为“国饮”，饮茶有益健康。儿茶素是一类多酚化合物，是茶多酚的主体成分，约占茶多酚总量的65%~80%，也是茶叶中有保健功能的主要成份之一。近年来，有研究表明，儿茶素EGCG和GCG对TY具有良好的体外抑制活性，但共抑制TY的分子机制尚不明确，限制了儿茶素作为天然TY抑制剂的应用研究。南昌大学食品学院张国文教授团队系统地研究了EGCG和GCG与TY的结合特性、对TY的抑制机制及其与曲酸的联合抑制

南昌大学食品学院张国文教授团队在Food Chemistry上在线发表了文章《Comparing the inhibitory abilities of epigallocatechin-3-gallate and gallocatechin gallate against tyrosinase and their combined effects with kojic acid》，该文系统地研究了表没食子儿茶素没食子酸酯和没食子儿茶素没食子酸酯与酪氨酸酶的结合特性、对酪氨酸酶的抑制机制及其与曲酸的联合抑制效应，研究结果对预防和治疗色素沉着性皮肤病以及控制果蔬的酶促褐变具有重要的理论意义和实用价值。该文将于Food Chemistry 2021年7月1日刊出。张国文教授为本文通信作者。

Highlights

* 表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）和没食子儿茶素没食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）以混合型方式可逆地抑制酪氨酸酶；

* EGCG与GCG联合使用对酪氨酸酶有协同抑制作用；

* 疏水作用和氢键主导了结合过程；

* EGCG和GCG均结合到酪氨酸酶的活性中心；

* EGCG和GCG的结合可诱导酪氨酸酶的构象伸展。

Introduction

酪氨酸酶（tyrosinase，TY）是黑色素产生的关键酶，在控制食物褐变和色素沉着性皮肤病中发挥重要作用。当TY过量存在或其活性过高时，黑色素可能会过度表达和聚集，从而导致皮肤疾病、食物褐变和虾黑变病等。抑制TY的催化活性，阻止酪氨酸氧化为黑色素并减少黑色素的产生已成为预防和黑色素沉着性皮肤病和控制食品酶促褐变的主要途径。茶是世界著名的三大饮料之一，在国外享有“健康之液，灵魂之饮”的美名，在我国被誉为“国饮”，饮茶有益健康。儿茶素是一类多酚化合物，是茶多酚的主体成分，约占茶多酚总量的65%~80%，也是茶叶中有保健功能的主要成份之一。近年来，有研究表明，儿茶素EGCG和GCG对TY具有良好的体外抑制活性，但共抑制TY的分子机制尚不明确，限制了儿茶素作为天然TY抑制剂的应用研究。南昌大学食品学院张国文教授团队系统地研究了EGCG和GCG与TY的结合特性、对TY的抑制机制及其与曲酸的联合抑制效应，研究结果对预防和治疗色素沉着性皮肤病以及控制果蔬的酶促褐变具有重要的理论意义和实用价值，同时为儿茶素的膳食营养提供实验依据。

Results and Discussion

EGCG和GCG对TY的抑制作用

EGCG和GCG均呈现浓度依赖性地抑制TY活性，其半数抑制浓度IC50值分别为39.4 ± 0.54 μM和36.8 ± 0.21 μM（图1）。EGCG和GCG是具有多个羟基的典型多酚化合物，这些结构非常有利于与TY的氨基酸残基产生氢键，从而促进儿茶素与TY的结合，降低TY的催化能力。EGCG和GCG均以混合方式可逆地抑制TY活性，它们通过与底物竞争结合到TY的活性中心而抑制酶的活性。GCG在反式构象中包含一个儿茶酚基团，这可能导致与大分子或溶剂相互作用的耐受性和灵活性增加，从而有助于其对TY的抑制。

EGCG、GCG与曲酸对TY的联合抑制作用

与EGCG、GCG单独抑制TY活性相比，EGCG与曲酸的联合使用抑制作TY的能力减弱，而GCG与曲酸联用、EGCG与GCG联用对TY的抑制作用增强（图2）。推断EGCG与曲酸联用对TY的抑制为拮抗作用，GCG与曲酸联用对TY的抑制为加和作用，而EGCG与GCG联用能够协同抑制TY。

EGCG、GCG与TY的结合特性

结果表明，EGCG、GCG均能通过与TY形成基态复合物而静态猝灭TY的内源荧光，在相同温度下，GCG显示出更强的荧光猝灭能力（图3）。EGCG和GCG在TY上存在1个结合位点，但GCG与TY的结合常数值高于EGCG，表明GCG更容易与TY结合，这归因于儿茶酚基团的顺、反式构象的差异，导致GCG的空间位阻小于EGCG。热力学分析结果表明，疏水作用力和氢键在EGCG / GCG-TY复合物的形成和稳定中发挥重要作用。

EGCG和GCG对TY的构象的影响

同步荧光光谱表明，EGCG和GCG均未显著影响Tyr和Trp残基的疏水性和极性，EGCG与TY的结合位点更接近Tyr残基，而GCG与TY的结合位点更接近Trp残基。圆二色谱结果表明，随着EGCG或GCG的加入，TY的二级结构含量发生明显变化（图4），当EGCG与TY的摩尔比从0:1增加到8:1， GCG与TY的摩尔比从0:1增加到1:1时，EGCG和GCG分别引起TY的α-螺旋含量从(32.16 ± 0.65)%减少到(29.69 ± 0.63)%和从(27.62 ± 0.20)%下降到(23.44 ± 0.96)%，而导致b-折叠含量则分别从(21.73 ± 0.22)%增加到 (24.92 ± 0.13)%和从(24.74 ± 0.81)% 增大到 (29.84 ± 0.32)%，EGCG或GCG与TY结合导致酶结构部分伸展。与EGCG相比，GCG诱导TY结构发生更明显的变化，这可以解释为什么GCG具有比EGCG更强的TY抑制能力。

分子对接研究

分子对接结果显示，EGCG通过疏水作用力与氨基酸残基His244、Val248、His263、Ser282和Val283相互作用，极性溶剂化自由能在总自由能中占很大比例，EGCG中A环上C5–OH(H)及D环上C11′–OH(H)分别与TY中His85(O)和Met280(O)形成两个氢键。GCG被His61、His85、Gly86、His244、Val248、His259、His263、 Arg268、Val283和Glu322残基包围，且观察到四个氢键（图5）。此外，His244、Val248和Val283参与疏水相互作用的形成，基于分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积（MM-PBSA）的自由能分解分析，结果表明极性溶剂化自由能对总自由能的贡献最大。氢键和疏水相互作用在稳定EGCG/GCG-TY复合物的结构中起着重要作用，这与荧光滴定实验结果一致。重要的是EGCG和GCG均与铜离子相互作用，而His61、His85、His244、His259和His263均位于TY的活性中心，可以进一步证明EGCG和GCG可能占据了活性中心底物的位点，通过扭转多肽链的结构改变了TY的构象，从而破坏了酶活性位点阻止底物被TY催化，最终抑制酶的催化活性。

分子动力学模拟

分子动力学模拟进一步评估了EGCG/ CG-TY复合物的结构和性质。图6显示，与EGCG或GCG结合后，EGCG/GCG-TY复合物的波动减少，酶的稳定性增强。EGCG与TY结合，使得TY结构变得疏松，但在GCG-TY结合中未观察到类似的影响。TY和EGCG/GCG–TY复合物之间的均方根涨落差异不明显，但是包括60-90 240-260 and 280-290处氨基酸残基显示明显的波动，证明氨基酸残基高灵活性是引起高均方根涨落值的主要原因，但酶与抑制剂之间的相互作用也会影响均方根涨落值。EGCG和GCG的存在对TY中的溶剂可及性表面积没有明显影响。分子动力学模拟结果支持了上述实验结果。由于EGCG或GCG与TY之间的相对位置不断变化，因此，EGCG与TY之间的氢键数量增加且在0至7之间变化。而从一开始在GCG和TY之间就产生氢键，并且氢键的数量逐渐增加并在0和6之间变化。这些结果进一步证实了分子对接的结果，表明氢键在EGCG或GCG与TY之间的相互作用中起着重要作用。

Conclusions

EGCG和GCG都以较好的TY抑制活性，其抑制类型为混合型，EGCG和GCG联合使用对TY显示出协同抑制效应。疏水作用力和氢键促进了EGCG和GCG与TY的自发结合，并导致TY内源荧光产生静态猝灭。EGCG和GCG的存在对TY中Tyr和Trp残基的微环境没有显着影响，但诱导了α-螺旋含量的减少和b-折叠含量的增加，从而导致TY结构的伸展。分子对接结果表明，EGCG、GCG通过疏水力和氢键与TY活性空腔中的氨基酸残基相互作用。氨基酸自由能分解的分析证明，疏水力在EGCG或GCG与TY的结合中起主要作用。分子动力学模拟表明氢键起到稳定复合物构象的作用。EGCG降低了TY结构的致密性，使TY结构疏松。因此，推测EGCG、GCG结合到TY的活性中心并与铜离子和关键氨基酸残基相互作用，占据底物的位置并引起TY二级结构的改变，从而阻止底物被催化，最终降低TY的活性。该研究为洞察儿茶素防治色素沉着性皮肤病和食品抗褐变机制提供了理论基础。

作者简介

张国文 教授

张国文，博士，二级教授，博士生导师，现任南昌大学食品学院副院长。入选2020年科睿唯安全球“高被引科学家”榜单，江西省“百千万人才工程”人选，江西省高等学校中青年学科带头人，南昌大学食品科学与技术国家重点实验室固定成员与学术带头人，国家自然科学基金同行评审专家，中国工程教育认证核心专家，江西省食品安全委员会食品安全专家委会委员，江西省食品科学技术学会理事，江西省微量元素与健康研究会理事，Food Chemistry、Journal of Agricultural and Food Chemistry、Food Hydrocolloids、Food & Function、Food Research International、Food and Chemical Toxicology、LWT - Food Science and Technology、Journal of Functional Foods、Analytical Chemistry、Journal of Hazardous Materials、International Journal of Biological Macromolecules等30多家国际学术期刊审稿人。近年来，主持国家自然科学基金、教育部博士点基金、国家重点实验室基金、江西省重大科技项目等国家和省级科研项目20多项，在国内外高水平学术期刊上发表论文270多篇，其中SCI收录论文120多篇，H指数36，Web of Science收录论文总被引3900多次。获得国家级教学成果二等奖3项，江西省教学成果一等奖2项、二等奖3项，科技部“振华-王赐义科技扶贫奖”，江西省自然科学三等奖2项，主编教材4部。

宋欣 硕士研究生

宋欣，女，南昌大学食品学院2018级硕士研究生，研究方向为功能食品与营养。在国内外学术期刊发表论文3篇，其中SCI论文2篇，包括在Food & Function上发表封面论文《Inhibitory mechanism of epicatechin gallate in tyrosinase: inhibitory interaction conformational change and computational simulation》和在Food Chemistry上发表论文《Comparing the inhibitory abilities of epigallocatechin-3-gallate and gallocatechin gallate against tyrosinase and their combined effects with kojic acid》。

该文章《Comparing the inhibitory abilities of epigallocatechin-3-gallate and gallocatechin gallate against tyrosinase and their combined effects with kojic acid》在线发表于Food Chemistry。点击下方了解更多即可查看摘要原文。