酸性条件和碱性条件对mirna的影响（植物miRNA的检测-范例1）

酸性条件和碱性条件对mirna的影响（植物miRNA的检测-范例1）从已鉴定的 milRNA 中随机选择三个 milRNA 候选物（milR001-5p、milR008-3p 和 milR004-5p），以及它们在木霉-番茄根相互作用期间不同时间点的表达水平（0、6、12、24 和48 hpi) 使用茎环 RT-qPCR 测量。使用 RSEM v1.1.17 [29] 计算已知和新型 milRNA 的表达水平并将其标准化为每百万转录本 (TPM)。 TPM 的值使用以下公式计算：TPM = 实际 miRNA 计数/（干净读数的总计数 × 106）。由于缺乏木霉属 miRNA 的数据，在 miRBase 数据库（第 21 版）中，将所有独特的 read（不包括 rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA、tRNA、mRNA 降解片段和重复序列）与权威 miRBase 数据库中其他物种的 miRNA 序列和前体序列进行比较，以使用 Bowtie2 筛选已知

Materials and methodsT.asperellumstrain plant material and sample collection

T. asperellum strain DQ-1 which was isolated and identified by our lab stored in the Engineering Center of Agricultural Microbial Preparation Research and Development of Hainan (Hainan University) and cultured on potato dextrose agar (PDA) medium. T. asperellum spore suspension (1×107 cfu/mL) was prepared with sterile water. and added evenly onto the tomato roots.

Seeds of tomato (inbred line “Xinfan 2”) were kindly provided by Associate Professor Yonghua Liu (College of Horticulture Hainan University). 150 seeds (50 seeds/replicate three replicates) were surface sterilized with 0.1% sodium hypochlorite for 10 mins and rinsed for five times with sterile water under aseptic conditions then placed on moistened filter paper cultured in the dark at 28°C for 48 h for germination. The germinated seeds were sown in growth medium consisting of vermiculite and perlite (3:1 v/v) and placed in a growth chamber at 28°C with a 12 h light-12 h dark photoperiod and relative humidity of 80%. After 4 weeks uniform tomato seedlings (20 seedlings/replicate) were selected and T. asperellum spore suspension (1×107 cfu/mL) prepared were added evenly onto the tomato roots. The roots were wrapped with tinfoil and incubated in the growth chamber (25°C 80%RH). T. asperellum was collected from tomato roots at 0 6 12 24 and 48 h after inoculation by washing the roots with sterile water. The rinse solutions were centrifuged at 12 000 rpm for 15 mins and the supeRNatants were discarded. The samples were quickly frozen with liquid nitrogen and stored in an ultra-low temperature freezer at −80°C.

RNA extraction sRNA library construction and high-throughput sequencing

为了筛选和鉴定与番茄根部相互作用的 T. asperellum DQ-1 的 sRNA，根据制造商的说明。使用 Trizol 试剂（Invitrogen，CA，USA）从不同时间点（感染后 0、6、12、24 和 48 小时，hpi）收集的样品中提取总 RNA。

使用 NanoDrop ND-1000 分光光度计（NanoDrop Technologies，Wilmington，DE，USA）测量 260 和 280 nm 处的吸光度，以光度计评估 RNA 浓度。使用 PEG8000 沉淀法富集 sRNA 片段，使用变性 15% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离长度为 18-30 nt 的 sRNA。 将纯化的 sRNA 连接到 Illumina 专有的 3' 和 5' 接头，并通过逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 进行扩增。 最后，纯化的 cDNA 片段在 Illumina HiSeqTM 2500 平台（基迪奥，Guangzhou，China）上进行测序。

数据处理

1. 由于原始 Illumina fastq 数据始终包含带有接头序列或低质量碱基的读数，因此在此基础上使用 TRIMMOMATIC v0.39 、FASTQC v0.118 和 FASTX_TOOLKIT v0.013 过滤原始数据以下标准中的一个：(1) 删除包含多个低质量碱基 (Q 值≤20) 或未知核苷酸 (N) 的读数，(2) 去除没有 3' 接头的读数，(3) 去除读数包含 5' 接头，（4）去除 3' 和 5' 接头之间没有 sRNA 片段的读数，（5）去除 sRNA 片段中包含 polyA 的读数，以及（6）去除短于 18 nt 的读数（不包括适配器）。
2. 使用 BOWTIE2 v2.4.1 和 SAMTOOLS v1.10 将更高质量的独特读数映射到 T. asperellum CBS 433.97 基因组 (https://mycocosm.jgi.doe.gov/Trias1/Trias1.home.html) 以获得比对位置信息，去除多余的 sRNA 序列，并过滤掉降解的 mRNA 片段。
3. 独特的序列，包括 rRNA、小细胞质 RNA (scRNA)、小核仁 RNA (snoRNA)、小核 RNA (snRNA) 和 tRNA，基于 GenBank 数据库的 BLASTN v2.9.0 搜索（E 值 0.01）进行注释（ 209.0 版）和 Rfam 数据库（11.0）。
4. 此外，REPEATMASKER v4.09 用于过滤掉源自 T. asperellum 基因组重复相关区域的读数。

潜在milRNA的预测和表达分析

由于缺乏木霉属 miRNA 的数据，在 miRBase 数据库（第 21 版）中，将所有独特的 read（不包括 rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA、tRNA、mRNA 降解片段和重复序列）与权威 miRBase 数据库中其他物种的 miRNA 序列和前体序列进行比较，以使用 Bowtie2 筛选已知的 milRNA 候选者。

为了预测新的 milRNA，本研究中使用了 MIREAP v0.20 [28]。

基于未注释的 sRNA 在 T. asperellum 基因组中的位置，使用 Mireap 基于以下标准鉴定了所有具有稳定发夹样结构的潜在前体：（1）最小 miRNA 序列长度为 18 nt，（2）最大 miRNA 序列长度为 25 nt，(3) miRNA 参考序列的最小长度为 20 nt，(4) miRNA 参考序列的最大长度为 23 nt，(5) miRNA 的最大拷贝数为 20，(6) 允许的最大自由能18 kcal/mol的miRNA前体，(7) miRNA和miRNA*之间的最大间距(前体中miRNA的互补序列，下同)为300 nt，(8) miRNA和miRNA*之间的最小间距为16 nt， (9) miRNA 和 miRNA* 之间的最大凸起为 4 nt，(10) miRNA/miRNA* 双链体的最大不对称性为 4 nt，以及 (11) miRNA 前体侧翼序列长度为 20 nt。

使用 RSEM v1.1.17 [29] 计算已知和新型 milRNA 的表达水平并将其标准化为每百万转录本 (TPM)。 TPM 的值使用以下公式计算：TPM = 实际 miRNA 计数/（干净读数的总计数 × 106）。

茎环 RT-qPCR

从已鉴定的 milRNA 中随机选择三个 milRNA 候选物（milR001-5p、milR008-3p 和 milR004-5p），以及它们在木霉-番茄根相互作用期间不同时间点的表达水平（0、6、12、24 和48 hpi) 使用茎环 RT-qPCR 测量。

从每个样品中提取总 RNA 并用 DNase I 处理以去除 DNA 模板 [30]。

使用 miRprimer v2.0 [31] 中设计的特定茎环 RT 引物将成熟的 milRNA 逆转录为互补 DNA (cDNA)。

逆转录反应 (10 μl) 包含 1 μl RNA (200 ng)、2 μl 5× Primescript® 缓冲液（Clontech，美国）、1 μl 茎环 RT 引物 (10 μM)、0.5 μl Primescript® RT Enzyme Mix I (5U)（Clontech，美国）和 5.5 μl 无 RNase dH2O。

qRT-PCR反应混合物（25 μl）包括1 μl RT产物、1×SYBR premix EX Taq Ⅱ®（Takara，大连，中国）、200mM正向引物和200mM反向引物。

qPCR反应条件为：95℃预变性15 min，94℃变性20 s，58℃退火延伸34 s，40个循环。通过 Eppendorf Mastercycler RealPlex® 检测系统监测反应。使用比较 Ct 方法 (ΔΔCt) 计算 milRNA 表达水平。 U6基因用作内参，每个 miRNA 在Mock的表达水平用作标准化对照。实验重复 3 次。 RT 引物和 qPCR 引物见 S1 表。

Target prediction and functional enrichment analysis of Trichoderma miRNAs

在 T. asperellum CBS 433.97 基因组 (https://mycocosm.jgi.doe.gov/Trias1/Trias1.home.html) 中鉴定的木霉 milRNA 的靶基因使用 PAMATCH v1.2 [32] 进行预测，并根据以下规则：（1）miRNA与其靶标之间的互补关系中不超过四个错配（GU碱基计为0.5个错配），（2）miRNA/靶标双链体中的相邻错配不超过两个，（3） miRNA/靶标双链体中 5' miRNA 的 2-12 位没有相邻错配，(4) miRNA/靶标双链体的 10-11 位无错配，(5) miRNA/靶标双链体的 1-12 位错配不超过 2.5 miRNA/靶标双链体中的 5' miRNA，以及 (6) miRNA/靶标双链体的最小自由能 (MFE) ≥ miRNA 与其完美互补序列结合的 MFE 的 60%。这些 milRNA 的靶基因也在木霉属中收集。使用 DAVID 基因注释工具 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/UTH) 进行 GO 术语和 KEGG 通路注释，以研究 milRNA 靶基因的功能 [33]。

Prediction and functional analysis of potential transboundary milRNAs

为了识别来自 T. asperellum 的潜在跨界 miRNA，使用 Blastall 将上面筛选的所有 milRNA 映射到来自 NCBI Refseq 数据库（登录号 GCF_000188115.4_SL3.0）的番茄基因组。对于完美映射到番茄基因组的 milRNA，将番茄基因组中匹配区域上游和下游的 100 bp 序列提交给 MFOLD 网络服务器 (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/ RNA-Folding-Form) 具有 -85 kcal mol-1 的最小自由能 (MFE) 值，以检查 milRNA 前体序列是否可以在番茄基因组中形成稳定的二级结构 [34]。未在番茄基因组中形成稳定二级结构且与番茄基因组不完全匹配的milRNA前体序列，按照以下步骤用于预测番茄靶基因。

使用 PSRNATARGET (http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/) 和 NCBI 番茄 (Solanum lycopersicum) 转录文库（登录号 GCF_000188115.4_SL3.0）进行潜在跨界 milRNA 的预测，以识别靶向番茄的 milRNA [35 ]。为了验证预测结果，还使用 ​PSROBOT 和 TARGETFINDER (https://github.com/carringtonlab/TargetFinder) 来检查筛选出的 milRNA 是否针对番茄转录文库 [36 37]。

PSRNATARGET 程序的更严格参数用于快速识别可能参与跨界基因调控的 milRNA。具体参数是：(1) sRNA-target 比对中不允许有间隙或凸起，(2) sRNA 的第十个核苷酸需要与其目标完全匹配，(3) 最多允许一个错配或两个摆动从成熟 sRNA 序列上的种子区域从第二个到第十二个核苷酸，(4) 最多允许两个连续错配，(5) 阈值截止值设置为 4.0。

在 PSROBOT 中，我们使用以下标准进行 milRNA 目标预测：（1）目标惩罚分数阈值设置为 4.0，（2）来自 5' 必需序列的第二到第十七个核苷酸作为种子区域，（3）没有在 sRNA-靶标比对中允许有间隙或凸起，并且 (4) 在互补序列的第 17 个核苷酸之后最多允许有一个间隙或凸起。在Tar​​getFinder中，miRNA靶基因匹配得分阈值设置为4.0，其他参数根据作者推荐设置。

如果所有三个程序都预测来自木霉属的 milRNA 在番茄中具有靶基因，那么它被认为是潜在的跨界 milRNA。为了尽量减少假阳性，我们只选择了所有三个程序预测的目标基因，我们使用 Blast2GO (https://www.blast2go.com/) [38] 注释了 milRNA 目标基因的功能。

翻译不严谨，使用goole直译