pcr技术的引物必须具有什么（引物特异性不够怎么办）

pcr技术的引物必须具有什么（引物特异性不够怎么办）梯度PCR是指在退火温度不太明确时，为了找到最优退火温度，在一台PCR仪上同时做多管PCR（需要在支持设置梯度退火温度的PCR仪），每一管放在仪器内不同列（有的是不同行）上，分别进行PCR（如50-60℃可以分6管，分别50℃，52℃，54℃，56℃，58℃，60℃），最终找到最合适的退火温度，并进一步以此退火温度进行普通PCR扩增。梯度PCR与降落PCR都是对反应体系中的退火温度进行优化，但两者在原理上有所不同。是指直接从样品中扩增目标DNA，无需进行核酸分离纯化。直接PCR中，在高温变性阶段，诸如细胞、组织等材料在特殊的缓冲液中被裂解，释放出DNA。因此这种方法简化了实验流程，减少了动手操作时间，同时可避免纯化过程中DNA的损失。今天分子实验室中所采用的菌落PCR鉴定就是直接PCR法的最直接的体现。可对直接样品简单处理或者稀释即可进行PCR反应。二、梯度PCR

1983年美国Mullis首先提出核酸体外扩增设想，1985年由其发明了聚合酶链反应（polymerase chain reaction PCR），意味着PCR技术的诞生。1988年，Saiki等人从Thermus aquaticm分离出了耐热型DNA 聚合酶，即Taq DNA聚合酶，成功完成了DNA的自动扩增，使PCR变成一种便利的、普遍的实用分子生物学技术。

但随着常规PCR技术在分子生物学各个领域的广泛应用，样本量少、样本珍贵、非特异性扩增等现象经常出现。造成非特异性扩增的原因有很多：普通的Taq DNA 聚合酶的最适温度是72℃，此时酶的活性最佳，低于此温度，酶有较弱活性，于是DNA聚合酶低温下具有活性而引起的错误引导靶标延伸和引物二聚体形成；使用热启动高保真酶时也会出现非特异性扩增，主要跟PCR的条件（Mg2 、退火温度、循环数等）有关。非特异性会造成目标扩增子产量低；目标扩增子的灵敏度下降；下游应用效果不佳等。

今天我们来说说如何能成功扩增我们需要的目的片段。

一、直接PCR

是指直接从样品中扩增目标DNA，无需进行核酸分离纯化。

直接PCR中，在高温变性阶段，诸如细胞、组织等材料在特殊的缓冲液中被裂解，释放出DNA。因此这种方法简化了实验流程，减少了动手操作时间，同时可避免纯化过程中DNA的损失。今天分子实验室中所采用的菌落PCR鉴定就是直接PCR法的最直接的体现。可对直接样品简单处理或者稀释即可进行PCR反应。

二、梯度PCR

梯度PCR与降落PCR都是对反应体系中的退火温度进行优化，但两者在原理上有所不同。

梯度PCR是指在退火温度不太明确时，为了找到最优退火温度，在一台PCR仪上同时做多管PCR（需要在支持设置梯度退火温度的PCR仪），每一管放在仪器内不同列（有的是不同行）上，分别进行PCR（如50-60℃可以分6管，分别50℃，52℃，54℃，56℃，58℃，60℃），最终找到最合适的退火温度，并进一步以此退火温度进行普通PCR扩增。

He Lingjuan et al. "Genetic lineage tracing of resident stem cells by DeaLT". Nature protocols 13.10 (2018):2217-2246.

三、降落PCR

PCR反应中许多成分，如引物、模板、Mg2 、dNTPs等均会导致实验结果的不准确，针对复杂的基因组DNA模板，普通PCR往往存在非特异性扩增，得不到需要的理想产物。为了解决PCR非特异性扩增的问题，Don等人于1991年发明了降落PCR（touchdown PCR，TD-PCR）技术。

与温度梯度PCR相比，降落PCR更有优势，因为采用梯度PCR选择合适的退火温度时需要多次反应或多管反应，并且即使通过多次试验找到最佳的退火温度后，在更换其它的PCR仪进行同样的扩增时，最适的退火温度也有可能发生改变，需要重新进行最佳温度的摸索。而降落PCR只需一次反应就可以获得很好的扩增效果，避免了对每对引物进行最佳复性温度的优化和测定工作，并且降落PCR在很大程度上削弱了仪器性能对扩增效果的制约。

原理

PCR反应中退火温度会对扩增结果产生影响，随着退火温度的升高，扩增特异性会变好，同时扩增效率会变低。降落PCR一开始先用高温扩增，可得到特异性扩增产物；待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，可提高扩增的效率。当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会有一个几何级数的优势，在剩余反应中非特异的位点由于丰度低无法和特异位点竞争，从而产生单一的占主导地位的扩增产物。

退火温度设置

通常降落PCR的退火温度范围可跨越15℃，从高于Tm值几度到低于其10℃左右，在每个温度上循环1-2个周期，然后在较低的退火温度上循环10个周期左右。

降落PCR应用

降落PCR适用于经常更换引物的实验，在不知道Tm值，同时不想很麻烦的找出最佳Tm值的情况下，使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。现在很多PCR仪具有设置降落PCR的程序，降落PCR在研究领域中已得到了广泛的应用。

注意事项

降落PCR虽然有一定的优势，但它并非万能，降落PCR只能做到“锦上添花”，即能看见主带，但是存在杂带，可以利用降落PCR进行优化，但是如果连主带也看不见，只有杂带，那么用降落PCR也不会有很好的效果。

四、巢式PCR

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通 PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，特异性的扩增位于首轮PCR产物内的DNA片段。

优势

如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。

实验步骤

第一步：第一对绿色引物结合到DNA模板上，同时由于特异性不够，也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增产物。

第二步：使用第二对黄色引物结合到第一步扩增的目的片段上进行第二轮扩增。由于第二对引物位于第一步PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。

最后祝愿大家新的学期实验顺利，文章接收，PCR势如破竹！