分子荧光分析法研究进展（开发基于纳秒光化学点击反应的新型原位蛋白质质谱技术）

分子荧光分析法研究进展（开发基于纳秒光化学点击反应的新型原位蛋白质质谱技术）基于以上原位标记技术，光化学微电泳和微热泳等技术，李灵军课题组开发出一种基于纳秒级光化学点击反应（nanosecond photochemical reaction nsPCR，图1a）的敞开式质谱探针（Ambient MS Probe）。这种探针不仅可以实现原位快速分离、去除干扰质谱检测的生物基质（图1b），还可以对高达155 kDa的大蛋白进行快速有效的高通量原位标记（图1c），从而达到根据表面暴露氨基数目的多少可以推断蛋白质结构的转变。作者使用了高分辨率质谱对这一系列光化学点击反应进行分子量水平的直接实时观测。图1. 纳秒光化学反应原理图及其在质谱直接检测时原位除基质和蛋白质快速标记两个研究方向的应用示意图. 图片来源（Li et al. Nature Communications 2019 doi: 10.1038/s41467-019-12548-0）化学分离技术，包括微电

目前基于生物质谱的蛋白质组学及相关定量技术正在经历飞速发展，然而现阶段的蛋白质鉴定和蛋白质结构分析往往需要使用不同的分析平台单独进行。这不仅降低了质谱分析效率，而且很难保证蛋白质结构分析的时效性（离线分析条件下蛋白结构可能发生未知的不可控的改变）。

近日，美国威斯康星大学麦迪逊分校李灵军课题组在Nature Communications杂志上发表了一篇题为“Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling”的文章，通过开发纳秒级光化学点击反应（nanosecond photochemical reaction nsPCR），改善了复杂高盐体系中蛋白质质谱的检测灵敏度，同时可以对蛋白质表面活性氨基进行标记，从而实现快速原位蛋白质结构分析。文章第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校李灵军课题组博士后李功玉，主要致力于新型原位蛋白质质谱技术开发及其在疾病相关蛋白质快速鉴定和结构分析中的应用研究。

在系统生物学和生物化学研究中，基于质谱的定量蛋白质组学已经成为一项主要的研究工具，特别是近年来越来越多的蛋白质标记技术的开发正在与日俱增地改善直接从复杂生物样品中进行蛋白质完整鉴定和相对、绝对定量的可行性。蛋白质组学质谱技术（Proteomics MS）和非变性质谱技术（Native MS），是目前普遍认可的用于蛋白鉴定和蛋白结构研究的代表性技术。然而，蛋白质的鉴定分析和结构研究往往是在不同条件下完成。如何实现同步进行蛋白质的原位鉴定和快速结构研究是现阶段蛋白质质谱领域的一大难题和挑战。同时实现蛋白鉴定和结构研究可以增加质谱技术的可靠性和实用性，尤其是能够提供更有生物意义、更接近生物体系中实际情况的蛋白质结构-功能关系的信息。尽管质谱技术曾经多次获得诺贝尔奖，质谱技术的一大硬伤是质谱检测的条件和生物体系实际条件差异巨大，因为质谱毕竟检测的是气相离子，而真正的生物蛋白体系无一例外都是在溶液相起作用的。

与此同时，敞开式质谱（Ambient MS）技术是近些年来越来越重要的一种能够实现无需样品制备、实际样品直接快速检测的质谱方法。该技术最早是美国科学院院士、普渡大学化学系教授Graham Cooks于2004年提出（Science 306 471-473 (2004)）。随后受到广泛关注，越来越多的研究人员对Ambient MS感兴趣并做出了很多相关的技术突破，一个主要的核心策略是要快速清除目标物周边的生物基质，以达到质谱兼容的条件。然而，Ambient MS 技术主要用于小分子的检测应用，在蛋白质大分子检测上则较难实现，主要受限于蛋白质在丰度和种类上的多样性。如何改进Ambient MS技术使之可以同时实现蛋白质鉴定检测和结构研究也是目前质谱研究领域的一大热点（Anal. Chem. 2014 86 1342−1346；Anal. Chem. 2018 90 3409−3415；Anal. Chem. 2016 88 10860−10866）。

化学分离技术，包括微电泳，是复杂体系中蛋白质和多肽质谱检测的一项主要辅助策略。近年来，为了改善化学分离技术的效率和实用性，人们将分离的时间和空间都缩短到了微尺度甚至纳尺度级别。值得一提的是，近期一系列高水平杂志（J. Am. Chem. Soc. 138 5363–5370 (2016)，Angew. Chem. Int. Ed. 49 2238–2241 (2010)）发表了关于光化学微电泳（PME，Photochemical Microscale Electrophoresis）技术的文章，报道了该技术通过荧光标记之后用于核酸相互作用的相关研究。PME依赖于激光辐射一个光敏小分子NBA（2-nitrobenzaldehyde），产生自由基NS-和游离的质子（H ）并因此生成局部电场。核酸在这种局部的电场中迁移，不同状态下的核酸迁移速率有差异，从而实现对不同状态核酸的分离分析。此外，另外一种微分离技术，微热泳技术（MST，Microscale Thermophoresis， Nat.Commun. 1 1–7 (2010)），基于温度梯度诱导的分子定向迁移，也被开发出来用于分离分析。

蛋白质的鉴定和定量其实更依赖于标记化学技术的开发和发展。因为几乎所有多肽和蛋白都带有高活性的氨基基团，目前定量蛋白质组学领域的标记试剂主要都是基于氨基的反应，包括市面上的TMT（tandem mass tag）和iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）。自从2010年开发报道DiLeu（N N-Dimethyl Leucine，Anal. Chem. 82 2817–2825 (2010).）标记试剂以来，李灵军课题组长期致力于改善蛋白质组学定量标记试剂的持续开发，包括标记效率、成本和标记的通量。此外，近期有一些报道，通过结合标记试剂和基质辅助激光解吸附离子源MALDI（Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization），质谱结果表明这可以实现原位标记化学，大大节省了标记时间。

这种原位标记化学技术其实是一种典型的点击反应。点击化学反应广泛应用于化学生物和材料等各个领域，其中就包括蛋白质的生物交联。2018年，法国南特大学（Université de）NantesGouin课题组在JACS上报道了一种基于蛋白质上酪氨酸的电化学点击反应，用于蛋白质的快速标记（J. Am. Chem. Soc. 140 17120–17126 (2018)）。同一年，英国剑桥大学Gaunt课题组则在Nature上提出一种针对甲硫氨酸特异性的蛋白质标记点击反应（Nature 562 563–568 (2018)）。

图1. 纳秒光化学反应原理图及其在质谱直接检测时原位除基质和蛋白质快速标记两个研究方向的应用示意图. 图片来源（Li et al. Nature Communications 2019 doi: 10.1038/s41467-019-12548-0）

基于以上原位标记技术，光化学微电泳和微热泳等技术，李灵军课题组开发出一种基于纳秒级光化学点击反应（nanosecond photochemical reaction nsPCR，图1a）的敞开式质谱探针（Ambient MS Probe）。这种探针不仅可以实现原位快速分离、去除干扰质谱检测的生物基质（图1b），还可以对高达155 kDa的大蛋白进行快速有效的高通量原位标记（图1c），从而达到根据表面暴露氨基数目的多少可以推断蛋白质结构的转变。作者使用了高分辨率质谱对这一系列光化学点击反应进行分子量水平的直接实时观测。

图2. 纳秒光化学反应增强神经肽的原位可视化表征。图片来源（Li et al. Nature Communications 2019 doi: 10.1038/s41467-019-12548-0）

作者首先在多种复杂基质条件下验证了方法的可行性，通过对比质谱图中的非特异性小分子杂质结合峰的比例，以及对质谱检测多肽的灵敏度等角度，考察了该纳秒光化学策略在提高原位蛋白质质谱检测中的作用。在此基础上，作者进一步将该方法应用到质谱成像中，主要集中在提高神经肽的质谱成像灵敏度上。正如图2所示，该方法不仅能够维持高丰度高响应的磷脂质谱信号和成像质量，还可以大大增加相对丰度较低、质谱响应较差的神经肽在质谱成像时的鉴定数以及成像图谱的质量也大大提高。这得益于纳秒光化学反应原位消除了基质干扰，也能够促进质谱成像重构脑部微区结构，如果能够在大气压敞开式条件下实现激光单细胞单神经元成像，该方法将会更加大放异彩，有望实现进一步的突破，比如单细胞原位蛋白质质谱成像等。

除了提高原位蛋白质质谱的灵敏度，作者还发现该方法可以用于在线、原位、快速标记多肽和蛋白质。图3显示该方法可以适用于各种多肽的高效标记。同时，作者也对标记的位点进行了测定，采用的是碰撞诱导解离的二级质谱方法，结合多种潜在位点封端的对照实验，详细而完整地揭示了纳秒光化学反应用于多肽蛋白质标记的原理。

最后，作者还将该方法应用于分析蛋白质糖基化对其结构的影响。通过理论计算对比该方法标记的表面氨基个数发现，该纳米光化学方法可以成功探测到表面暴露度大约40%的活性氨基。而当蛋白质结构由于外界条件变化而完全变性时，该方法则可以几乎探测到所有的活性氨基基团。该纳秒光化学方法还揭示蛋白质表面的糖基化（唾液酸化）修饰可能会使一个糖蛋白（转铁蛋白）结构趋于收紧，表面可接触的活性氨基数目低于表面无糖基化的对照组 （图4）。而这种糖基化的修饰在实际生物体系包括人体中是非常常见的，此前有报道老年痴呆症中的该类型糖基化有显著变化。值得注意的是，更为传统的结构质谱方法，离子迁移质谱（Ion Mobility-Mass Spectrometry）并未能够成功检测出该糖基化对蛋白质结构的影响。这说明该纳秒光化学方法具有较高的结构探测灵敏度，未来可以用于更多的，基于MALDI-MS的蛋白质结构鉴定分析中。这也将拓展这一新型质谱技术的应用领域。

图3. 纳秒光化学反应用于多肽的高效标记。图片来源（Li et al. Nature Communications 2019 doi: 10.1038/s41467-019-12548-0）

图4. 纳秒光化学反应用于大蛋白的标记和结构探测。图片来源（Li et al. Nature Communications 2019 doi: 10.1038/s41467-019-12548-0）

虽然本文只在多肽和蛋白的氨基上进行实验，该方法亦可用于含有氨基的小分子分析。相关工作正在开展中。关于本文更详细的技术细节，请感兴趣的读者阅读文章英文全文（Li et al. Nature Communications 2019 doi: 10.1038/s41467-019-12548-0）或者可以直接联系通讯作者。

主要作者简介

李灵军，通讯作者，美国威斯康星大学麦迪逊分校药学院教授，2000年于美国伊利诺伊大学香槟分校获得化学博士学位 之后在美国太平洋西北国家实验室和布兰迪斯大学进行博士后研究。2002年起在美国威斯康星大学麦迪逊分校任教。现任威斯康星大学麦迪逊分校药学院和化学系双聘教授，获威斯康星大学Charles Melbourne Johnson药物科学与化学杰出讲座教授和Vilas 杰出成就教授称号。李灵军教授长期致力于生物分析科学以及质谱相关技术的研究 主要涉及的领域有神经肽组学、蛋白质组学、代谢组学等 并应用这些尖端的分析方法和技术解决神经生物学、基础和临床医学中的关键性问题。

李灵军课题组（已毕业46位博士生，22位在读博士生，6位博士后）在生物分析化学领域的贡献主要在构建基于高灵敏度质谱多维分析平台 并应用此平台于新型神经肽组学研究 在高水平杂志上发表论文280多篇 受邀学术报告200余场。李教授先后被授予分析化学个人成就奖（匹兹堡会议）、美国国家科学基金委生涯奖、美国质谱学会研究奖、斯隆基金会研究奖 以及2014 年Biemann Medal。2016年入选全球50位最有影响力女分析化学家。2019年 入选分析科学家Top 100 Power List (全球100位最有影响力的分析科学家)。李灵军教授现任美国质谱学会（JASMS）副主编和分析与生物分析化学（Analytical and Bioanalytical Chemistry）编委会成员。

李功玉，第一作者，现为美国威斯康星大学麦迪逊分校李灵军教授课题组博士后，曾在中科大黄光明教授课题组攻读博士学位期间（2012年 - 2017年）开始学习质谱，并在2016年和2019年先后两次访问美国密歇根大学Brandon Ruotolo教授实验室学习离子迁移质谱。自2017年8月加入李灵军课题组以来，李博士的主要研究兴趣包括开发基于离子迁移质谱和敞开式大气压质谱的原位蛋白质质谱新方法，用于解决人类疾病相关蛋白质在复杂体系中的直接鉴定和快速结构分析的技术难题及相关拓展应用。李博士的相关工作已以其为第一作者身份发表了包括2篇Nature Communications，3篇Analytical Chemistry和1篇Trends in Analytical Chemistry等在内的多篇业内高水平研究论文。鉴于其在原位蛋白质质谱领域的创新性研究成果，李博士于2019年被美国质谱学会授予该年度博士后职业发展奖（2019 ASMS Postdoctoral Career Development Award）。

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