可降解生物材料的降解机理（J.Hazard.Mater.通过强化微生物降解处理三氯生）

可降解生物材料的降解机理（J.Hazard.Mater.通过强化微生物降解处理三氯生）首先先探讨了PH值的影响，将分离的细菌培养液(2% v/v)在不同pH(5、6、7、8、9、10)条件下，以10 mg/L的TCS初始浓度培养24 h。24 h后采集样品，分析残留TCS (mg/L)和相应的生物量浓度(mg/L)。下图描述了初始pH对TCS降解和生物量比生长速率(µ-)的影响。结果表明，在pH = 7时，TCS的最高降解率为93.5%，对应于0.063 mg/L/hr的特定生长速率。在pH 5和pH 9时，TCS的降解率分别为45%和64%，低于pH 7时的降解率。随后作者进行了降解实验，在250 mL的烧瓶中进行批量生物降解实验，其中含有100 mL MSM TCS浓度分别为2 mg/L、5 mg/L和10 mg/L。此外，还通过改变pH值、接种量大小和其他碳源(如葡萄糖和初级处理废水)的存在来评估Providencia MB-IIT菌株的降解能力。早期的研究报道，锰

大家好，今天推送的文章来自于发表在Journal of Hazardous Materials 上的“Treatment of triclosan through enhanced microbial biodegradation”，作者为印度理工学院的P. Balakrishnan。

三氯生(Triclosan TCS)是一种合成的多氯苯氧基苯酚，具有脂溶性，同时具有醚官能团和酚官能团。三氯生是一种抗菌剂，有报道称三氯生能有效阻断合成代谢途径的脂肪酸合成，限制微生物的生长。三氯生已广泛应用于化妆品、牙膏、家用、工业清洁和个人护理产品。全球TCS年产量估计在1500吨左右，用于700种不同的工业和消费产品，浓度范围为0.1-0.45%(重量/体积)。因此，大量的TCS被释放到环境中，特别是水环境中，可能会对水生生物产生负面影响。

废水排放是水环境中TCS的主要来源。三氯生具有持久性、毒性和较高的生物积累潜力，导致内分泌紊乱、生长抑制，从而影响水生生物和人类健康。据报道，传统的活性污泥(CAS)处理(生物降解和吸附机制)只能去除初始TCS浓度的32-80%，剩余的TCS留在二级出水中。在CAS处理系统中，TCS的残留浓度在二级处理出水和生物固体中显著。在经过二次处理的废水中，TCS的浓度范围为23ng/L到3350 ng/L，而在生物固体中，其含量范围为100ng/g - 462 ng/g 。这些观察到的浓度远远高于淡水藻类(55 ng/L)和甲壳类(2000 ng/L)的毒性水平。这表明，需要一个额外的或创新的处理系统来去除残留的TCS浓度，并将其浓度保持在其阈值影响水平以下。

研究人员研究了使用活性炭(AC)吸附、高级氧化工艺(AOP)，如芬顿试剂、臭氧化、超声波和紫外线(UV)辐照处理废水中的TCS 。但这些方法存在废活性炭再生处理、芬顿试剂氧化污泥管理、转化中间体新产品生成、运行维护成本较高等缺点，难以在实际污水处理工艺中实施。据报道，氧化过程中产生的中间产物可能比TCS的毒性更大。另一方面，生物处理工艺(BTP)是一种环境可持续发展的技术，可使有机污染物大量矿化而不产生有毒副产物。此外，与AOPs相比，生物处理工艺需要更少的操作和维护成本。三氯生是一种众所周知的难降解化合物，但污水污泥中的某些特定细菌可以降解三氯生。但这些细菌可能在废水污泥中生长缓慢或数量较少。

在此背景下，研究生物强化工艺是否有助于提高废水中TCS的处理效率。生物强化是指在现有废水处理过程中引入驯化或独特的菌株，以提高微生物活性和降解难降解化合物的技术。菌株必须是活跃的，持久的，兼容的，并应该能够在复杂的碳环境中工作/生存。大多数情况下，从废水中鉴定出的细菌最适合生物强化工艺。这种生物增强概念已成功应用于处理由多环芳烃(PAH)污染的废水和土壤中的双酚A、孕酮等复杂有机污染物。此外，细菌降解动力学的评价对生物处理系统的有效设计具有重要意义。一些研究报道，从污水处理厂鉴定的细菌如鞘氨醇单胞菌sp. pH0.7、鞘氨醇单胞菌菌株KCY1和jostii红球菌RHA1被证明可以降解TCS 。然而，TCS向中间产物转化的机理和生物降解机理的识别有待于进一步研究。此外，了解参与降解难降解有机污染物的酶是必要的。

作者研究工作的主要目标是发展一种新的生物降解方法去除城市废水中的TCS。为此采取的方法包括(i)确定城市污泥中TCS降解菌。通过16S rRNA基因序列分析对从活性污泥中分离出的菌株进行鉴定，(ii)定量鉴定出的细菌通过拟议的生物强化处理去除TCS的有效性。优化实验条件，促进TCS降解，促进细菌活性生长，更好地理解生物强化技术的有效利用，(iii)识别TCS转化为中间产物，并阐明可能的生物降解途径。此外，还研究和报道了降解TCS的关键酶的作用。

作者先进行了TCS降解菌的分离与鉴定，目的是从城市污水污泥中分离细菌菌株，这些污泥可以使用三氯生作为碳源和能源。对生长在50 mg/L TCS浓度下的菌株进行了筛选和鉴定。在三个菌落中，只有一个菌落能够在50 mg/L TCS浓度下快速生长。对分离的菌株进行16s rRNA分析。构建了菌株分类的系统发育树。下图描述了已鉴定菌株与其他闭合细菌菌株的系统发育关系。在图中，节点处的数字指示基于1000个重新采样的数据集的邻居加入分析的引导支持的级别。系统发育树中的条形图显示遗传距离为0。最高同源性为99%，表明所观察到的菌株属于Providencia rettegeri MB-IIT菌株。

随后作者进行了降解实验，在250 mL的烧瓶中进行批量生物降解实验，其中含有100 mL MSM TCS浓度分别为2 mg/L、5 mg/L和10 mg/L。此外，还通过改变pH值、接种量大小和其他碳源(如葡萄糖和初级处理废水)的存在来评估Providencia MB-IIT菌株的降解能力。早期的研究报道，锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(LAC)等酶可以高效地降解废水中的TCS。研究还发现，MnP和LAC酶在降解纸浆造纸厂的有毒废水、废水中存在的抗生素和抗抑郁药方面也很有效。在降解结束时，对实验样品进行MnP和LAC酶活性分析。

首先先探讨了PH值的影响，将分离的细菌培养液(2% v/v)在不同pH(5、6、7、8、9、10)条件下，以10 mg/L的TCS初始浓度培养24 h。24 h后采集样品，分析残留TCS (mg/L)和相应的生物量浓度(mg/L)。下图描述了初始pH对TCS降解和生物量比生长速率(µ-)的影响。结果表明，在pH = 7时，TCS的最高降解率为93.5%，对应于0.063 mg/L/hr的特定生长速率。在pH 5和pH 9时，TCS的降解率分别为45%和64%，低于pH 7时的降解率。

孵育24 h后，进行酶活性测定，以检测锰过氧化物酶和漆酶活性。酶活性测定结果表明，在中性pH条件下，pH值为7时，MnP酶活性(1.5±0.28 IU/mL)和LAC酶活性(0.34±0.04 IU/mL)达到最大值。LAC酶活性随pH值变化不显著。而MnP酶活性在pH=7时达到最大值。而与酸性和碱性pH相比，MnP活性在pH值为7时最大。真实废水的pH值会因废水来源的不同而不同。经鉴定的P. retgeri能够在较宽的pH范围内生长，并分泌用于TCS降解的酶。因此，P. retgeri可以应用于实际废水的处理。

随后作者做了接种量大小的影响的实验，菌株的接种量大小对处理效率有显著影响。较高的接种量可能导致细菌生长缺乏营养，导致污染物降解不良。相反，较小的接种量可能导致其无法有效地降解污染物。为优化接种量，在TCS浓度为10 mg/L的条件下，采用不同初始接种量(v/v)在1% ~ 5% (v/v)范围内进行分离培养。在不同接种量为1-5% (v/v)时，测定了TCS的降解水平和特定生物量的生长速率，如下图所示。结果表明，接种量为2%和3%时，TCS的有效去除率分别为96%和92%。当接种量为2% (v/v)和3% (v/v)时，生物量比增长率分别为0.06 mg/L/hr和0.054 mg/L/hr。当接种量为4% (v/v)和5% (v/v)时，TCS去除率分别为58%和42%。

这表明随着接种量大小的增加，TCS去除率降低，因此进一步的实验研究采用2% (v/v)的接种量。当接种量为4%和5%时，去除率较低，这是由于缺乏营养和细菌生物量之间的竞争。测定了不同接种量下的MnP和LAC酶活性。对于2% (v/v)的接种量，MnP酶活性为1.6±0.12 IU/mL LAC酶活性为0.3±0.04 IU/mL。

随后作者对P. rettgeri MB-IIT降解TCS的动力学进行了研究。采用MB-IIT菌株对不同浓度的TCS进行降解实验。TCS残留浓度随时间的变化曲线如下图所示。TCS残留浓度急剧下降，说明生物量生长没有迟滞期。retgeri菌株MB-IIT在初始浓度为2 mg/L、5 mg/L和10 mg/L时对TCS的降解率分别为97±1.5%、95±0.4%和93±2%。从浓度谱图中，比较TCS的实验半衰期，即达到初始浓度一半的时间，如图所示。例如，TCS初始浓度为10 mg/L，从图a中插值达到5 mg/L的时间。结果表明，当TCS浓度为2、5和10 mg/L时，TCS的半衰期分别为3 h、5.6 h和6.34 h。

ln(Co/C)与时间(h)的关系表明，TCS的降解遵循一级动力学规律。利用一级动力学方程计算了理论半衰期。图b为三种TCS初始浓度的一级动力学图。动力学分析表明，2、5和10 mg/L TCS的半衰期分别为3.1 h、5 h和6.8 h，降解速率常数(k)分别为0.22 h-1、0.14 h-1和0.1 h-1。从半衰期(t1/2)的实验和理论预测来看，雷氏杆菌MB-IIT对TCS的降解符合一级动力学。使用单一细菌培养物进行TCS生物降解的工作非常有限。利用好氧活性污泥系统尝试TCS生物降解时，TCS初始浓度为2 mg/L时，t1/2为82 h 。固定化漆酶降解TCS的t1/2估计为0.60 h 。TCS在有氧土壤中的实验室生物降解研究表明半衰期为18天。根据一级反应动力学模型估算，当TCS初始浓度为30µg/g时，向本地需氧微生物添加二鼠李糖脂独白，TCS的半衰期为16.06 h 。本研究是首次使用细菌分离物P. rettgeri MB-IIT来评价TCS生物降解动力学。

随后作者研究了碳源的影响，在优化的实验条件下，加入外源碳源(如葡萄糖)和初处理废水，考察分离菌株对TCS的降解能力。生物质对TCS的吸附去除率仅为7%左右，这可能是微不足道的。TCS在废水和葡萄糖存在下的降解率高于MSM。TCS在废水和葡萄糖中的比生物量生长速率分别为0.1 mg/L/hr和0.12 mg/L/hr。MSM的比生物量增长率为0.063 mg/L/hr。同样，在废水和葡萄糖的存在下，MnP和LAC酶活性高于MSM。额外碳源的存在促进了生物质的生长和酶的活性。这清楚地证明了所鉴定的雷氏拟南芥菌株能够在其他碳源存在的情况下生长和降解TCS。由此可以推断，该菌株具有有效利用废水中有效碳来增强TCS生物降解的潜力。

采用LC-HRMS分析对降解实验中形成的TCS生物降解中间产物进行预测和鉴定。降解过程中观察到m/z 301、m/z 279、m/z 259、m/z 245、m/z 134和m/z 113六个中间产物离子，其中m/z 289代表TCS。根据质谱分析(m/z值)和报告数据，确定了可能的化学结构。从实验结果可以推测，P. rettgeri MB-IIT菌株对TCS的降解遵循两条降解路径。甲基化和完全矿化是两种生物降解途径。苯酚环在TCS结构中的存在在好氧生物降解过程中发生甲基化。TCS被P. rettgeri MB-IIT菌株对OH基团进行生物甲基化，生成中间产物m/z 301 (P1)。这种TCS降解机制与其他好氧生物降解过程一致。然而，TCS降解过程中甲基化过程的生化反应尚不清楚。TCS通过另一种降解途径的脱氯和降解/矿化联合转化为中间产物P2 (m/ z279)。中间P2被降解或矿化，形成中间产物P4 (m/ z245)。中间产物P1中碳-碳(C-C)键的降解和开环形成中间产物P3 (m/ z259)。TCS中的C-C键被分子氧取代，LAC酶负责分子氧的转移，打开TCS中的C-C键。中间产物P3的醚键断裂脱氯生成中间产物m/z 134 (P6)。中间产物P5 (m/z 113)可能是由中间产物P4的C-O键裂解脱氯或中间产物P3的醚键裂解脱氯形成的。

这两种机制都可能生成中间产物P5。据报道，MnP和LAC酶的氧化是生物降解过程中醚键裂解的关键过程。这种醚键断裂和脱氯机制在其他菌株降解TCS中被观察到，如鞘氨醇单胞菌KCY1 、鞘氨醇单胞菌YL-JM2C和Dyella sp. WW1 。中间产物P5和P6进一步降解为低分子羧酸并矿化(H2O和CO2)。总的来说，P. rettgeri MB-IIT菌株对TCS的降解可能发生了连续和/或同时的醚键裂解、降解和脱氯反应。生物降解实验结束时，三氯生初始浓度为2 mg/L、5 mg/L和10 mg/L时，氯浓度分别为0.5 mg/L、1.62 mg/L和3.15 mg/L。据估计，5mg /L的TCS化学计量释放的氯离子浓度为1.84 mg/L 。但在本研究中，5 mg/L时氯离子浓度仅为1.62 mg/L。此外，从废水污泥中鉴定出的rettgeri MB-IIT菌株的脱氯能力低于Sphingopyxis菌株KCY1和Dyella sp. WW1 。结果提示，样品中仍可能存在氯化三氯甲烷代谢物。

整理：张经纬

文章信息：

doi:10.1016/j.jhazmat.2021.126430

文章链接:https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2021.126430