猪的育种经历了几个阶段（突破传统猪育种的技术障碍）
猪的育种经历了几个阶段（突破传统猪育种的技术障碍）猪作为人类主要的肉类来源，是十分重要的农业经济动物。而猪的育种在养猪产业中起着非常关键的作用。基因修饰技术能够通过人为的方式改变生物的基因组遗传信息，以期改良生物的性状或建立新的品种，从而提高农业的经济回报。其主要包含转基因技术和基因编辑技术；常用的动物转基因技术有显微注射法、体细胞转染法、逆转录病毒法、转座子介导法等；常用的动物基因编辑技术主要有三种，锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFN）技术、转录激活子样效应物核酸酶（Transcription activator-likeeffector nucleases，TALEN）技术、成簇规则间隔的短回文重复序列相关核酸酶（Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9，CRISPR/Cas9）技
猪基因修饰育种技术
张贤君 吴霄 蔡更元 吴珍芳 李紫聪
华南农业大学动物科学学院 国家生猪种业工程技术中心
摘要
随着基因修饰技术的迅猛发展，该技术已能够精确修饰生物体的特定基因并实现人为改造生物的重要性状。随着该技术在猪育种工作中的应用，猪的重要性状改良研究取得重大进展。本文将介绍用于制备基因修饰猪（主要包括转基因猪和基因编辑猪）的转基因技术和基因编辑技术的作用原理，并介绍基因修饰技术在改良猪重要性状方面的进展，以增加对猪基因修饰育种技术的了解。
关键词：猪 基因修饰技术 育种
前言
基因修饰技术能够通过人为的方式改变生物的基因组遗传信息，以期改良生物的性状或建立新的品种，从而提高农业的经济回报。其主要包含转基因技术和基因编辑技术；常用的动物转基因技术有显微注射法、体细胞转染法、逆转录病毒法、转座子介导法等；常用的动物基因编辑技术主要有三种，锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFN）技术、转录激活子样效应物核酸酶（Transcription activator-likeeffector nucleases，TALEN）技术、成簇规则间隔的短回文重复序列相关核酸酶（Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9，CRISPR/Cas9）技术。这些技术已经成功应用于多种哺乳动物物种。
猪作为人类主要的肉类来源，是十分重要的农业经济动物。而猪的育种在养猪产业中起着非常关键的作用。
纯系选育和配套杂交是猪传统育种的重要手段，能培育出具有优良性状的种猪群，但其需要较长的选择周期和大量的人力、物力，且改良程度受限于物种自身种质资源，无法突破物种间隔引入新性状。这些缺点制约了猪的育种发展。
与之相比，转基因猪育种技术以及基因编辑技术能有效地弥补这些不足，其突破了上述传统育种方法的技术障碍，实现了基因组的精确修饰，进而大幅度提高育种效果。因此，基因修饰猪的研究对猪生产性状的改良和特定性状的培育等方面有重要的应用价值。
本文将结合各种基因修饰技术的作用原理，对其在改良猪重要生产性状如增加猪肉产量、改善猪肉品质，提高抗病性和饲料利用率等方面的应用研究进行综述，以增加对猪基因修饰育种技术的了解。
1 制备基因修饰猪的主要技术
1.1 制备外源基因随机整合的转基因猪的主要技术
制备转基因猪的步骤包括目标基因的确定，供体细胞的选择，质粒载体的构建，目标外源基因导入，外源基因整合、转录及表达的分子检测，体细胞核移植或人工受精，胚胎移植，转基因猪的纯化扩繁等。本节将主要介绍外源基因导入以及整合所涉及到的部分技术及其原理，大致流程是通过显微注射或转染的方式将包含外源基因的载体质粒导入细胞内，利用合适的载体质粒整合外源基因到基因组中，再进行体细胞核移植或者人工受精，最后经胚胎移植制备转基因猪。
1.1.1 显微注射导入法
原核显微注射法（Pronuclear microinjection，PNI）一直被认为是经典的制备转基因动物的方法，已经成功应用于转基因猪的制备。该方法利用显微操作技术将外源基因直接注射到猪受精卵原核中，使目标基因整合到基因组中，然后通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体母猪子宫内，进而获得转基因猪。由于PNI的技术操作要求高，成本高，其推广应用受到一定的限制。
卵胞质注射法（Cytoplasmic microinjection，CI）可通过微量注射针将外源基因直接注射到猪的受精卵胞质内而获得转基因胚胎。与PNI相比，CI具有操作简单、胚胎损伤小和胚胎体外停留时间短等优点，降低了对技术人员的要求，同时能显著提高注射胚胎的存活率。
卵胞质内单精子注射法（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）是一种基于精子载体法的动物转基因技术。其原理是将去除精浆的单个精子与外源基因共孵育后直接注射入卵母细胞胞浆内，形成受精正常的转基因胚胎。因此，ICSI可以解决猪卵母细胞体外受精过程中多精受精严重的问题，此外，有研究发现该方法的转基因大部分呈多拷贝单位点，有利于基因稳定表达，可以看出ICSI在转基因猪生产中极具应用潜力。
1.1.2 体细胞转染导入法
体细胞转染是将外源基因导入到动物体细胞中，并与宿主基因组整合并表达的过程。其中脂质体质粒转染法效率较高，是目前实验室最为常用的方法之一。其原理是脂质体表面带正电荷，能与带负电荷的包含外源基因的质粒结合形成复合体，从而克服细胞膜的静电排斥将外源基因导入细胞内。外源基因通过质粒载体介导整合到宿主细胞基因组中，经筛选鉴定后进行体细胞核移植制备转基因猪。但质粒的转染效果不稳定，转染效率受实验因素影响作用大，且存在毒性导致细胞损伤，该转染法有待优化。
1.1.3 逆转录病毒介导法
逆转录病毒介导法整合外源基因的原理是根据逆转录病毒的长末端重复序列（Long terminal repeated，LTR）区域具有转录活性这一特点，将外源基因连接到LTR进行重组包装形成高滴度病毒颗粒，直接感染受精卵或注射到囊胚腔中，使携带外源基因的反转录病毒DNA整合到宿主基因组中。利用该方法制备转基因猪，具有基因表达效率高，单一位点整合，易分析插入位点等优点。但其包装工艺较复杂，且具有潜在的致癌性，存在安全隐患，因此该方法在转基因猪的制备中使用较少。
1.1.4 转座子介导法
转座子即跳跃基因，在原始位置上进行剪切或复制，经环化后在转座酶辅助下插入到宿主基因组的其他位置，例如哺乳动物的PiggyBac（PB）转座子。通过注射或转染将构建好的PB转座子质粒导入宿主细胞内，转座子特异性识别“TT-AA”序列位点，将其介导的外源基因插入该位点中，进而制备转基因猪。PB转座子具有安全高效、负载容量大、定位简单等优点，被广泛用于制备转基因动物。但是PB转座子介导法仍然存在外源基因插入位置和拷贝数随机性的缺陷。
1.2 制备定点整合或修饰的基因修饰猪的主要技术
传统转基因技术，如显微注射、慢病毒、转座子等将目的基因插入到动物基因组内的整合方式是随机的，基因插入位点和拷贝数都不确定，进而使外源基因在动物体内表达不稳定，对后期转基因动物的育种繁殖有诸多不利，因此有研究人员提出了定点整合转基因技术。影响定点整合转基因技术效率的因素有很多，其中整合位点的选择是外源基因定点整合最关键的一点。随着友好基因座位点Rosa26和H11在猪基因组中的发掘，利用基因编辑技术可以将外源基因置于友好基因座进行定点整合，获得各组织无差异稳定表达外源基因的转基因猪。
基因编辑技术（Gene editing technologies，GETs），是一种利用人工核酸内切酶对生物体基因组目的基因进行精确修饰的技术。其原理是：内切酶通过特异识别和切割基因组的特定位置产生DNA双链断裂（Double strand break，DSB），激活细胞的修复机制——非同源末端连接修复（Nonhomologous end joining，NHEJ）或供体质粒同源重组修复（Homologous-directed repair，HR），在该位点实现基因敲除、插入、碱基替换、点突变等定点修饰。该技术结合已有的转基因导入技术和体细胞核移植制备基因修饰猪，可以实现在猪体内目标基因的定点修饰、高效表达、稳定遗传，显著提高研究和生产基因修饰猪的效率。友好基因座的开发和基因编辑技术的出现为今后安全、高效地制备基因修饰猪奠定了基础。
1.2.1 ZFN技术
ZFN是一个含锌指蛋白（Zincfinger protein，ZFP）结构域和限制性核酸内切酶Fok I的融合核酸酶，依赖靶标基因序列的上下文序列进行定点修饰。由两个ZFP单体结构域各自识别并结合单链DNA上特定的三联子核苷酸序列，而具有核酸内切酶活性的二聚化的Fok I切割靶标基因序列，从而形成DNA双链断裂。ZFN技术是最早被广泛应用的基因定点修饰技术，各物种数据库资源都比较完善，然而其高度依赖于靶标基因序列，且上下游序列和三联属性设计较为繁琐，限制了ZFN技术的应用发展。
1.2.2 TALEN技术
TALEN与ZFN相似，其核心成分是转录激活因子样效应物（Transcription activator-likeeffector，TALE）和限制性核酸内切酶Fok I。TALE中串联重复元件的第12和13个氨基酸残基高度可变，被称为重复可变双残基（Repeat variabledi-residues，RVD），决定TALE的特异性。TALE识别并结合特定的单链DNA序列，而二聚化的核酸内切酶Fok I将靶标基因序列切割产生DNA双链断裂。TALEN技术是目前商业化最成功的技术，很多商业公司可以提供组装好的TALEN模块，大大缩短了构建TALEN元件的实验周期，但成本较高。
1.2.3 CRISPR/Cas9系统
CRISPR/Cas9系统由核酸内切酶Cas9蛋白、CRISPR-derived RNA （crRNA）和反式激活的CRISPR RNA（tracrRNA）组成。该系统的工作原理是crRNA融合到tracrRNA上形成向导RNA（Single guide RNA，sgRNA)，然后sgRNA引导Cas9蛋白定位到与crRNA配对的双链DNA序列靶位点上。sgRNA上与宿主基因组DNA互补配对结合的序列决定着CRISPR/Cas系统的靶向特异性。接着Cas9蛋白对原型间隔毗邻序列（Protospacer adjacent motif，PAM）上游3-8bp位置的序列靶位点进行切割，从而产生DNA双链断裂。
与ZFN技术和TALEN技术相比，CRISPR/Cas9系统在设计合成上更为方便简单，成本更低，靶向修饰精确度更高，并且可以同时进行多个基因的编辑，然而如何降低脱靶效应等方面的问题还需要进一步研究。
2 基因修饰技术在改良猪重要性状上的研究进展
2.1 增加猪肉的产量
猪肉是我国主要的肉类食品来源，提高猪肉产量和瘦肉率是当前猪育种工作中的重要目标。
肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）是肌肉生长和发育的关键负性调控因子。小鼠、牛等的MSTN基因的天然突变会导致肌肉肥大，出现“双重肌肉”特征。但猪中没有发现相关的天然突变，因此利用基因修饰技术模拟天然突变成为猪种改良的一种思路。
2012年，Qian等使用ZFN技术和体细胞核移植技术成功获得了MSTN基因突变的基因编辑梅山猪。与野生型梅山猪相比，MSTN基因突变的梅山猪个体瘦肉产量提高了11.62％，个别肌肉块的重量可达到两倍重。随后，吴添文等利用TALEN技术分别成功制备了MSTN基因编辑梅山猪和大白猪，且获得MSTN双等位基因编辑梅山猪初代群。
2015年，Wang等通过CRISPR/Cas9系统定点突变猪胎儿成纤维细胞的MSTN基因，利用MSTN基因敲除单细胞菌落制备MSTN双等位基因突变的克隆猪，该猪表现出特定的“双肌臀”表型。该研究的脱靶突变评估表明，其使用的基因编辑平台能有效地产生具有生物安全性的基因编辑猪。除此之外，在其他肌肉生长相关的调控因子上，比如影响骨骼肌发育及脂肪沉积的胰岛素样生长因子2（Insulin-like growthfactor 2，IGF2）和调节动物脂肪沉积和抗寒产热代谢的解偶连蛋白1（Uncoupling protein 1，UCP1），都有相关研究成功制备出基因修饰猪，改良猪的生长性状，提高生产效益。
2.2 提高猪肉的品质
随着物质生活水平的提高，人们更加追求健康饮食。猪体缺乏饱和脂肪酸脱氢酶，无法自主合成不饱和脂肪酸，因此猪肉中含有大量的饱和脂肪酸，食用过量容易增加心脑血管疾病的发生风险。秀丽隐杆线虫的Fat-1基因编码一种脂肪酸脱氢酶，能将n-6多不饱和脂肪酸（n-6PUFAs）转化为n-3多不饱和脂肪酸（n-3PUFAs），后者可以降低心血管疾病危险。
到目前为止，已经有许多研究成功地利用基因修饰技术实现猪肉品质的改善。2006年，Lai等在猪中过表达秀丽线虫Fat-1基因，通过细胞转染和体细胞核移植技术成功培育出了猪肉中富含n-3PUFAs的转基因猪。
2018年，Li等通过CRISPR/Cas9系统将秀丽线虫的Fat-1基因定点整合到猪Rosa26基因座中，并成功获得了Fat-1基因在Rosa26位点上有单一拷贝的转基因猪。气相色谱分析证实了该基因在猪肌肉组织中的表达，n-6PUFAs/n-3PUFAs比值明显降低。
这些转Fat-1基因猪有望改善猪肉产品的营养健康价值，并成为研究n-3PUFAs预防和治疗冠心病、免疫介导性疾病等多种临床疾病的动物模型。
虽然猪的肉质性状是重要的经济性状，但由于对其遗传机制的解析非常有限，目前只有少数几个肉质性状的主效基因被鉴别。
此外，影响猪肉品质的因素除脂肪中不饱和脂肪酸含量等内在因素外，肉色、肌间脂肪含量和肌纤维类型等也是目前猪肉品质研究的热点。因此关于猪肉质性状的育种改良还有很大的研究空间。
2.3 提高抗病性
猪病频发给养殖业带来了巨大的经济损失，同时人畜共患病和食品安全也威胁着人类的健康。
科研人员意识到单纯依靠药物和疫苗无法彻底控制猪病，从遗传的角度上利用基因修饰技术研究培育新的抗病品种已经有所发展。猪繁殖与呼吸障碍综合症（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），也被称为蓝耳病，会引起幼猪呼吸疾病和妊娠母猪的繁殖障碍，是危害养猪业最严重的病毒传染病之一。PRRS病毒靶向巨噬细胞，CD163是巨噬细胞表面的主要受体基因，在PRRS病毒建立感染中起关键作用。
2018年，杨化强等利用CRISPR/Cas9系统敲除了猪基因组中SRCR5结构域的CD163基因，通过体细胞核移植技术成功制备了CD163基因敲除猪。这些猪感染PRRS病毒后与野生型相比表现为无病毒血症、抗体应答、高热等其他PRRS相关临床症状。
结果表明，敲除CD163基因可使猪对PRRS病毒感染产生完全抗性，且不影响与该基因相关的生物学功能表达。除了蓝耳病以外，对于伪狂犬、口蹄疫、圆环病毒病、流行性腹泻和非洲猪瘟等猪病，如果可以用相同的手段进行抗病育种研究，将对提高猪抗病性具有重要推动作用。
2.4 提高饲料利用率
玉米、大豆和小麦等植物饲料原料中含有大量的植酸，即肌醇六磷酸。植酸具有很强的螯合能力，能与钙、镁、锌、氨基酸和淀粉等形成难以消化的络合物，使饲料中多种营养的消化率和消化酶的活性下降。植酸酶能有效分解植酸，提高氮、磷利用率，降低粪便中氮、磷的排放量。
2001年，Golovan等首次利用小鼠腮腺启动子，通过原核显微注射法培育出可在唾液中分泌植酸酶的转基因猪，提高了猪对饲料中植酸磷的利用率，使猪粪中的磷含量显著下降。
随后，转葡聚糖酶、转木聚糖酶及转纤维素酶等转基因猪的相继出现，使得猪对饲料中蛋白、纤维素、磷等营养物质的利用率提高，进而显著减少磷、氮排放。由于转单一消化酶基因猪对饲料中多种成分消化效果甚微，
最近，国家生猪种业工程技术研究中心张献伟等将4种微生物的酶类基因bg17A、eg1314、xynB以及eappA整合到猪的基因组中，利用体细胞核移植获得了唾液腺共表达葡聚糖酶、木聚糖酶及植酸酶的转基因猪。该猪在饲养过程中氮磷排出显著减少，饲料转化率有所提高，生长速度快，育肥出栏快。该研究有望缓解养猪业的环境污染和粮食消耗等问题。
展望
随着生物技术的不断发展和成熟，越来越多的基因修饰猪模型产生，近年来基因编辑技术的广泛应用更是大大地促进了基因修饰猪的研究进展。
猪基因修饰育种技术能够有效提高猪群生产性能和抗病性能，降低动物生产的成本，同时还在提供疾病模型、猪器官的异体移植以及猪作为生物反应器等方面起着重要作用。
未来，在猪的育种研究上可以继续朝着基因修饰技术与全基因组关联分析方法结合的方向发展。通过猪全基因组单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）基因芯片测定和大规模、高通量的全基因组序列分析分型方法，加深认识等位基因序列变异与表型性状之间的关系，发现新型遗传标记，并结合基因修饰技术精准验证SNP位点，确定优良性状的关键基因，以最大限度地提高基因改良和育种改良。
虽然猪基因修饰育种技术的应用十分广泛，然而现实中转基因或基因编辑猪的产业化推广和应用仍有诸多障碍需要克服。消费者对基因修饰动物的肉、奶、蛋的接受程度较低，并且这些产品所涉及的监管制度有待完善。
此外，基因修饰技术上还存在着许多潜在问题，例如体细胞核移植制备克隆猪的效率依然很低，外源基因定点整合效率低，基因编辑技术的脱靶风险和诱发突变等。如果能够解决这些难题，基因修饰育种技术有望迅速改良种质，从而大幅度提高畜牧产业的生产力和可持续性。
作者：张贤君
华南农业大学动物科学学院，动物遗传育种与繁殖专业2019级研究生，导师李紫聪教授。
来源：《猪业》2020年第4期文章
原标题：猪基因修饰育种技术
