质粒提取的方法和原理（质粒提取与纯化）

质粒提取的方法和原理（质粒提取与纯化）分子筛是基于分子大小差异进行纯化的一种层析方法。质粒工艺的第一步层析使用分子筛填料Sepharose 6 FF进行组群分离，主要去除RNA等小分子杂质。质粒和杂质的分子量差异很大，因此上样体积可以达到0.3 CV。除了杂质去除外，还可以达到缓冲液置换目的。RNA去除 — Sepharose 6 Fast Flow正如图1所示，在超螺旋质粒DNA纯化路线中，层析步骤主要应用于步骤6、步骤7、步骤8等部分，用于达到RNA的去除、超螺旋质粒DNA纯化、精纯等目的。Cytiva经典纯化超螺旋质粒DNA三步法第一步

Cytiva层析产品从Sepharose到Capto基架迭代的征程，从Capto离子交换层析、Capto疏水相互作用层析到Capto亲和层析产品不一而足，从单一带电荷性质或疏水性质到复合模式应对复杂纯化条件，以及应对不同的亲和层析亦有不错的选择。

图1：Cytiva亲和层析纯化超螺旋质粒DNA路线：1.发酵培养；2.收获；3. 裂解；4.澄清；5.浓缩；6.RNA去除；7.超螺旋质粒DNA纯化；8.精纯；9.浓缩；10.制剂

超螺旋质粒DNA纯化

超螺旋质粒DNA可以作为一种基因载体，广泛应用在核酸疫苗和细胞质粒/基因治疗的瞬转阶段。将编码某种抗原的外源基因与质粒载体重组，构建成为真核表达载体，称之为核酸疫苗。通过肌肉注射等途径直接导入动物细胞，利用宿主细胞的蛋白质合成系统合成外源抗原蛋白，并诱导宿主细胞产生对该抗原的体液和细胞免疫应用，以达到预防和治疗疾病的目的。

正如图1所示，在超螺旋质粒DNA纯化路线中，层析步骤主要应用于步骤6、步骤7、步骤8等部分，用于达到RNA的去除、超螺旋质粒DNA纯化、精纯等目的。

Cytiva经典纯化超螺旋质粒DNA三步法

第一步

RNA去除 — Sepharose 6 Fast Flow

分子筛是基于分子大小差异进行纯化的一种层析方法。质粒工艺的第一步层析使用分子筛填料Sepharose 6 FF进行组群分离，主要去除RNA等小分子杂质。质粒和杂质的分子量差异很大，因此上样体积可以达到0.3 CV。除了杂质去除外，还可以达到缓冲液置换目的。

图2：用Sepharose 6FF将RNA与DNA分离

第二步

超螺旋质粒DNA纯化 — Capto PlasemidSelect

Capto PlasmidSelect是一种嗜硫亲和层析填料，可以特异性将开环的质粒 (ocDNA)和超螺旋的质粒 (scDNA)分开。该填料是在上一代填料PlasmidSelect Xtra的基础上进行的升级，Capto PlasmidSelect可以在更高的流速条件下获得更高的载量，其DBC可以达到3 mg/ml，超螺旋质粒DNA的纯度可以提高到95%以上。

图3：用Capto PlasmidSelect将开环ocDNA和超螺旋scDNA分开

第三步

超螺旋质粒DNA精纯 — Capto Q ImpRes或SOURCE 30Q

Capto Q ImpRes或SOURCE 30Q作为高分辨率精纯步骤，可在大部分杂质去除之后的补充步骤，进一步去除痕量杂质及内毒素。

图4：用SOURCE 30Q精细纯化pDNA

小 结

Cytiva为超螺旋质粒DNA的纯化所开发的三步法层析步骤，具有操作简单、纯度高、易于放大等优势。同时，随着工艺的不断提升，更多的Capto基架填料也不断应用其中：例如基于沉淀法，Capto疏水相互作用层析和Capto离子交换层析的两步法工艺；又例如基于复合模式Capto Core 700和Capto疏水相互作用层析的升级版两步法工艺。