蛋白煮沸变性后可以长时间保存吗？蛋白变性后可以存放多久
蛋白煮沸变性后可以长时间保存吗？蛋白变性后可以存放多久答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Westernblot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。答：NaF 是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。3、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和 WesternBlot 试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？
1、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时 Marker 转上去了，为什么？
答：可能是：a)样品浓度过低；b)转移时间不够。
2、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加 NaF 等？
答：NaF 是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。
3、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和 WesternBlot 试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？
答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Westernblot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。
4、做 WesternBlot 时，提取蛋白后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到 120μg，换了个 santacloz 的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加 PMSF行吗？
答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查 WesternBlot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加 PMSF 就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
5、细胞水平要做 westernblot，多少细胞提的蛋白够做 westernblot？
答：一般 5×10^6 就足够了。
6、同一样品能同时提 RNA 又提蛋白么？这样对 westernblot 有无影响？
答：能，没有问题。
7、同一蛋白样品能同时进行两种因子的 WesternBlot 检测吗？
答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
8、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，这时最好加上 NaF 去抑制磷酸化酶的活性。
9、我的样品的蛋白含量很低，每微升不到 1 微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？
答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，加 20％甲醇。
10、想分离的蛋白是分子量 200kd 的，SDS-PAGE 电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作 WesternBlot 吗？
答：200kd 的蛋白不好做，分离胶用 7％，积层胶 3.5％。
11、如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？
答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载 30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试 1.5mm 的。
12、蛋白变性后可以存放多久？
答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。
13、我所测定的蛋白分子量是 105KD，按理说分离胶应当采用 7.5%，但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？
答：上述提到的两种凝胶均可以使用，因为 105KD 的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
14、二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否
要作调整，能否再用 5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？
答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．
15、问一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
答：WesternBlot 一般上样 30－100 微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合 WesternBlot 的怎样做也不行。
文章来源：每日生物评论
欢迎关注每日生物评论，或Bio-review
用最专业的精神，开放性的思维，与你一起探索行业走向，快速了解这个领域！
