nk活性检测是什么？ADCC效应检测新方法
nk活性检测是什么？ADCC效应检测新方法肿瘤细胞激活NK 细胞的机制可以分为两种：一种是丢失MHC I的肿瘤细胞，因丢失了抑制信号而成为了NK细胞的目标。另一种是过表达激活性配体的肿瘤细胞，会结合更多激活性受体而使激活信号增强，克服抑制信号，从而被NK细胞杀伤。图1 NK细胞识别健康细胞MHC INK细胞表面有众多受体，分为激活性受体Activating receptors和抑制性受体Inhibitory receptors两类。健康细胞通过MHC I类分子，与NK细胞表面的抑制性受体结合，使NK细胞处于静息状态，避免误伤。
DCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 中文名称是“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用”。NK细胞是介导ADCC的主要细胞，今天咱们就聊聊基于NK细胞的ADCC疗法。
ADCC效应机制
当IgG抗体通过Fab段与靶细胞（病毒感染的细胞或肿瘤细胞）表面抗原决定簇特异性结合后，其Fc段可与有FcγR受体的效应细胞（NK细胞、单核-巨噬细胞、中性粒细胞等）结合，触发效应细胞的杀伤活性，直接杀伤靶细胞。
NK细胞有慧眼
NK细胞表面有众多受体，分为激活性受体Activating receptors和抑制性受体Inhibitory receptors两类。
健康细胞通过MHC I类分子，与NK细胞表面的抑制性受体结合，使NK细胞处于静息状态，避免误伤。
图1 NK细胞识别健康细胞MHC I
肿瘤细胞激活NK 细胞的机制可以分为两种：一种是丢失MHC I的肿瘤细胞，因丢失了抑制信号而成为了NK细胞的目标。另一种是过表达激活性配体的肿瘤细胞，会结合更多激活性受体而使激活信号增强，克服抑制信号，从而被NK细胞杀伤。
图3. 基于NK细胞的ADCC疗法
上述两种ADCC疗法中的抗体起到了调控NK细胞活性的作用，是抗肿瘤抗体药物研发的重点。在这类抗体的研发过程中，NK细胞是常用来检测抗体ADCC效应的细胞。
NK细胞检测抗体ADCC效应
使用NK细胞能真实反映抗体对靶细胞的ADCC效应，但是NK细胞通常需要从全血或者PBMC中进行分离，需要较高的实验技巧，实验周期长且实验结果不易重复。传统的检测ADCC效应的方法有以下三种：
ADCC效应检测的最经典的方法是铬51(51Cr) 标记/释放法。将具有放射性的铬51与靶细胞孵育，铬51会进入靶细胞；洗去多于未进入细胞的铬51，再将靶细胞和效应细胞以及抗体共同孵育。如果靶细胞被杀伤，铬51就会被释放出来，检测溶液中的放射性同位素含量即可确认靶细胞被杀伤的情况。该方法是ADCC检测靶细胞被杀伤的金标准，然而因为带有放射性元素、费时费力且实验变化性大而较少使用。
细胞毒性测试 (Cytotoxicity assay) 利用类似铬51的原理但使用荧光的方法来检测靶细胞的死亡，如calcein-AM本身没有荧光且很容易地进入活细胞，进入活细胞后就变身成强荧光的calcein，若细胞被杀伤，荧光信号就可以在胞外被检测到。此方法可用于高通量快速筛选并获得实验同质性高的结果，然而效应细胞自身也会裂解导致高背景值的讯号产出。
CFSE(carboxy fluorescein succinimidyl ester)，利用双重染料：CFSE标记靶细胞，FVD标记死细胞，以流式细胞术来定量ADCC杀伤靶细胞的方法。此方法以多参数方法进行检测，操作简单并可获得可信的实验结果。
ADCC效应检测新方法
InvivoGen开发检测ADCC效应的报告基因细胞，可替代传统的依赖于NK细胞毒性活性的检测方法，用于抗体药物的初期筛选，大大提高筛选效率。在生物实验中，使用基因工程改造的人源T细胞系来检测NFAT（活化T细胞核因子）激活，这是ADCC诱导的早期信号。通过测量NFAT依赖的荧光素酶报告蛋白产生的生物发光信号，可以显示ADCC的诱导水平。
ADCC效应报告基因细胞系
Jurkat-LuciaTM NFAT-CD16细胞
由人源T淋巴细胞Jurkat细胞系进行基因工程改造而得。细胞系在最小启动子和6个NFAT反应原件的控制下稳定表达Lucia荧光素酶报告基因，以及细胞表面Fc受体CD16a（FcγRIIIA; V158高亲和力同种异体）。Jurkat细胞天然表达NFAT功能性信号通路。
Jurkat-LuciaTM NFAT-CD16细胞已经用不同的靶细胞和特定的单克隆抗体同种型组合进行功能测试。
产品特点：
稳健可靠：结果重复性高
快速：在一天内完成生物测定（总培养时间7小时）
方便：优化效应与靶细胞的比例、荧光读数仪即可进行检测
高性价比：20代内均可保持基因稳定。
图4. ADCC报告细胞基础检测法
1-ADCC 诱导：将表达表面抗原的靶细胞与特异性单克隆抗体一起培养1小时，之后以适当的靶效比添加Jurkat-LuciaTM NFAT-CD16效应细胞并培养6小时。
2-添加荧光素酶检测试剂Quanti LucTM : 将检测试剂添加到上清液样品中。3-ADCC测量：使用荧光读数仪检测生物发光信号。
免疫检查点抑制剂靶细胞
Raji-hCTLA4细胞
Raji-hPD-1细胞
Raji-hPD-L1细胞
Raji-hTIGIT 细胞
这四个细胞系属于Raji（人B淋巴细胞）衍生靶细胞系列，这些靶细胞不仅稳定表达免疫检查点如人CTLA-4、人PD-1、PD-L1、TIGIT，而且表达肿瘤抗原如HER2、EGFR和CD20（Raji 细胞天然表达的抗原）。
实验数据：
图5. 使用Raji-hCTLA4靶细胞比较抗人CTLA4天然和工程化同种型的ADCC效应
将Raji-hCTLA4细胞与梯度稀释的抗-hCTLA4或抗β-半乳糖苷酶单克隆抗体培养1小时。然后把Jurkat LuciaTM NFAT-CD16效应细胞与靶细胞共培养6小时。通过使用Quanti-LucTM 测定上清液中荧光素酶活性来评估。
