牛血清成分，牛血清技术手册
牛血清成分，牛血清技术手册当血清在未完全化冻状态时直接置56℃水浴或者灭活过程中局部受热过高时会产生胶状沉淀，导致血清无法继续正常使用。血清灭活后出现的沉淀大多数是纤维蛋白析出，属正常现象，灭活过程多次摇晃使血清受热均匀可以降低蛋白的析出；1、如何正确热灭活？将正常化冻后的血清56℃30分钟进行灭活，期间应进行多次摇晃使其受热均匀。2、为什么血清灭活后产生大量沉淀，有时在底部还会出现胶状物质？
第八章 细胞培养及牛血清使用中的常见问题和解答
一、血清中常见的沉淀物问题
科研人员在使用血清时常常会遇到各种沉淀问题，血清中可能会存在以下种类的沉淀物：
- 纤维蛋白：实验室人员血清化冻后发现有絮状沉淀，它是由纤维蛋白的凝聚产生，对血清质量没有任何影响。纤维蛋白是最常见的沉淀物，肉眼可观察的到，直径达到1-2mm。纤维蛋白的析出与血清冻存时间、化冻次数、化冻方式等有关，属正常现象，不影响细胞培养。
- 盐析出（如磷酸钙），也是常见沉淀物之一，镜下观察可见晶体或者小黑点，并且在37℃培养的时候会增加，这些小黑点由于布朗运动看上去像是在活动，因此经常被误认为是微生物污染。
- 胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质。
- 其他可能会增加沉淀的情况：
- 热灭活
- 长期在不适宜的温度环境中存放
- γ射线照射
- 配制试剂时pH的变化
二、血清常见的热灭活问题
1、如何正确热灭活？
将正常化冻后的血清56℃30分钟进行灭活，期间应进行多次摇晃使其受热均匀。
2、为什么血清灭活后产生大量沉淀，有时在底部还会出现胶状物质？
血清灭活后出现的沉淀大多数是纤维蛋白析出，属正常现象，灭活过程多次摇晃使血清受热均匀可以降低蛋白的析出；
当血清在未完全化冻状态时直接置56℃水浴或者灭活过程中局部受热过高时会产生胶状沉淀，导致血清无法继续正常使用。
3、血清灭活的目的
血清热灭活目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质，但是在胎牛血清中对补体的灭活则明显没有必要。Triglia和Linscott曾对商业胎牛血清中的补体成分进行测定，他们发现胎牛血清中含有的C1、C6仅达成年动物血清的1-3%，而其它补体成分仅有成年动物的5-50%，至于补体的主要成分C3在胎牛血清中则几乎不能检出。通过补体固定实验，我们也在多个不同批次的胎牛血清中获得了相似的结果。即使是在未稀释的血清中，也未发现有明显的溶血现象。多数实验室在培养前将培养液进行预热的过程，也对热敏的补体有灭活的作用。
热灭活另一个目的是为了使支原体失活。
4、什么是灭能？
灭活和灭能是同一个意思，叫法不同。
5、是否所有血清使用前必须灭活？
多数细胞培养中血清的热灭活并不是必要的。很多场合下，热灭活并不会改善细胞的生长，却降低了支持细胞生长的能力。即使在少数有促进的情况下，其促进的比率也是微不足道。另外，血清的热灭活导致的沉淀常常被认为是微生物污染，从而给用户和供应商都带来不必要的麻烦。因此建议，对血清进行灭活的用户，需要通过试验来证实其必要性。
三、牛血清微生物污染问题汇总
1、造成细胞培养污染的几种可能性
人员操作污染
环境污染：超净工作台、层流空气
细胞、培养基、胰蛋白酶、牛血清、PBS等
与培养基直接接触的器具：移液管、吹管、移液枪枪头、培养的容器等
2、微生物污染的种类
细菌、真菌、支原体、噬菌体及其他病毒等。
3、疑似微生物污染时采取的措施
肉眼观察培养基是否浑浊，然后镜下观察初步确认是否污染；
用细胞培养物分别接种到细菌、真菌等专门的微生物培养基中进行培养，最终确认是否是微生物污染；
一旦确认发生污染，应确认污染的真正原因防止二次发生，然后应对环境进行彻底消毒，相关器具、试剂、培养基停止使用，重新配制试剂培养基，对相关操作人员进行培训，然后重新复苏细胞。
四、细胞培养常见问题
1、如何正确储存和解冻血清
建议拿到血清后根据外包装说明，通常保存温度在-10~-30℃条件下保存。
将血清从冷冻箱取出后，置于2～8℃冰箱使之缓慢融解，一般过夜融解。如果一次无法用完整瓶血清，可以根据使用情况将血清分装至多个无菌的容器中，冷冻保存。
2、血清的保存时间
血清在-10~-30℃冷冻的条件下可保存五年，化冻后置于2～8℃环境中建议在两周内使用完。
3、添加L-谷氨酰胺后培养基的有效期
L-谷氨酰胺在细胞培养时可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。因此，应在培养基使用前添加L-谷氨酰胺，并尽快使用。
4、细胞冻存管应如何解冻？
将冻存管从液氮罐中取出后迅速投入37℃热水中不断摇动，1~2分钟内使之全部融解。该过程必须注意安全（戴护目镜），预防冷冻管之爆裂。
5、如何让细胞适应新的培养条件
应采取逐步替换的过程：通过1:2、1:1、2:1，最后用新的培养基完全替换。该过程中最好保留一瓶完全由最初的培养基培养的细胞，防止细胞适应失败，降低风险。
6、EDTA在细胞消化过程中起什么作用？
EDTA是一种螯合剂，它可以螯合Ca2 或Mg2 ，而细胞表面很多和培养皿或培养瓶结合的蛋白都是带有Ca2 或Mg2 的，把这些离子螯合后，可以加速细胞和培养皿的脱离，促进消化。在胰酶消化细胞时，加入EDTA，可以使细胞更好地分散成单个细胞。
7、如何用台盼蓝计数活细胞？
制备细胞悬液，在0.1毫升的细胞悬液中加入0.1毫升的0.4％的台盼蓝溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼蓝，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
8、培养细胞死亡可能的原因
(1)pH不适宜
(2)培养箱内温度波动太大
(3)细胞冻存或复苏过程中损伤
(4)培养液渗透压不正确
(5)培养液中有毒代谢产物堆积
(6)胰蛋白酶消化过度
(7)微生物污染
(8)细胞老化
建议解决方法：
(1) 检查培养箱内CO2 是否符合培养要求 ，调整培养基pH值
(2) 检查培养箱内温度，尽量选择水套式培养箱，保证稳定的培养温度
(3) 规范冻存、复苏流程，取新的保存细胞，建立细胞种子库和工作库，及时冻存状态较好的细胞
(4) 检测培养液渗透压
(5) 及时更换新鲜培养液
(6) 缩短消化时间或降低胰蛋白酶浓度
(7) 参照本章（三、3、疑似微生物污染时采取的措施）
(8) 重新复苏细胞，规定细胞使用代次
