开讲啦太空异种（拟南芥MTV1的pull-down实验）
开讲啦太空异种（拟南芥MTV1的pull-down实验）4. 谷胱甘肽琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：G4510）3. MS培养基混合维生素和MES缓冲液（Duchefa Biochemie BV，目录号：M0255.0010）1. 含表达重组GST-MTV1融合蛋白（诱饵）质粒的BL21大肠杆菌注：本例中，将MTV1编码序列克隆到一个修饰过的pGEX-2T质粒（General Electric Company，目录号：28-9546-53）上，载体构建采用Gateway的方法。2. 仅表达GST标签的BL21大肠杆菌作为阴性对照
摘要
本方案介绍了如何使用pull-down实验分析蛋白之间可能存在相互作用的一个例子(Sauer et al. 2013)。将感兴趣的诱饵蛋白（在本例中是拟南芥的MTV1）融合GST标签并在细菌中表达。接着通过GST标签与谷胱甘肽结合的琼脂糖珠基质结合，将诱饵蛋白分离出来。清洗去除细菌裂解液中提取的非特异性结合蛋白。将天然的植物蛋白提取液通过基质，诱饵GST-MTV1和猎物蛋白之间就会发生结合。再次清洗去除非特异性结合的蛋白质。最后，将诱饵和猎物蛋白质从珠子中释放出来。使用免疫印迹分析识别与GST-MTV1结合的蛋白质。此外，需要同时分析单独由GST标签组成的阴性对照，以排除猎物蛋白与GST-MTV1诱饵结合是由GST标签引起的可能性。
关键词：pull-down、相互作用、网格蛋白、 MTV1（mtv1）、EPSIN（epsin）
材料与试剂
1. 含表达重组GST-MTV1融合蛋白（诱饵）质粒的BL21大肠杆菌
注：本例中，将MTV1编码序列克隆到一个修饰过的pGEX-2T质粒（General Electric Company，目录号：28-9546-53）上，载体构建采用Gateway的方法。
2. 仅表达GST标签的BL21大肠杆菌作为阴性对照
3. MS培养基混合维生素和MES缓冲液（Duchefa Biochemie BV，目录号：M0255.0010）
4. 谷胱甘肽琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：G4510）
5. 完全抑制剂（不含EDTA）(Roche Diagnostics，目录号：11 873 580 001)
6. 苯甲基磺酰氟（PMSF）（如Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
7. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
8. 羧苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C9231）
9. 异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）（Sigma-Aldrich，目录号：I6758）
注：应配制成1M的原液，在-20℃下保存。
10. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771，或任何其他供应商）
注：可制备20%（重量/体积）的水溶液，并在121℃下高压灭菌15min。
11. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516，或任何其他供应商）
12. Tris（羟甲基）氨基甲烷（Tris）（Sigma-Aldrich，目录号：252859，或任何其他供应商）
13. 酵母膏（Sigma-Aldrich，目录号：Y1625，或任何其他供应商）
14. 色氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：95039，或任何其他供应商）
15. Anti-GST多克隆抗体（选配）（Carl Roth，目录号：3998）
16. Anti-CHC单克隆抗体（可选）（BD Biosciences，目录号：610499）
17. 液氮
18. NaCl（任何供应商）
19. KCl（任何供应商）
20. Na2HPO4（任何供应商）
21. KH2PO4（任何供应商）
22. β-硫基乙醇
23. 液体培养6-8天的拟南芥幼苗
24. MS培养基（见配方）
25. PBS（见配方）
26. 洗涤液（见配方）
27. 提取缓冲液（见配方）
28. 上样缓冲液（见配方）
29. LB培养基（见配方）
设备
1. 1.5和2mL标准反应管的微离心机（任何制造商）
注：无论是冷藏或位于4℃的冷室，应能达到16000×g。
2. 用于50mL离心管的冷冻离心机（任何制造商）
注：应能达到4℃和3000×g。
3. 超声发生装置（微型音调类型）
注：我们使用B. Braun的labsonic已经不再生产了。但是任何适合于小体积（2-5mL）的尖端式超声器设备都可以用于实验，例如与MS3超声管耦合的UP100H设备（Hielscher超声技术）。
4. Poly-Prep色谱柱（Bio-Rad Laboratories，目录号：731-1550）
5. 锥形烧瓶
6. 纸巾
7. 1.5mL小型离心机，能够支持16000×g（任何供应商）
8. 50mL聚丙烯锥型离心管（任何供应商）
9. 0.20µm滤膜（如Minisart® Sartorious，目录号：17597）加上兼容的5mL注射器
10. 37℃震荡培养箱培养细菌（任何供应商）
11. 25℃摇床或室温下的摇床（任何供应商）
12. 立式圆筒形混合机（任何供应商）
13. 能够在600nm处测量光密度的分光光度计（任何供应商）
14. 研钵和研棒（直径约10cm）（任何供应商）
步骤
1. 提前规划
表达GST-MTV1和GST蛋白的细菌培养沉淀物可在-80℃下保存数周，因此可提前制备。植物提取物在实际pull-down实验当天优先制备。得到这些植物材料需要8-10天（从种子消毒到收获）。Pull-down实验可以在一天内完成。
2. 细菌中的蛋白质表达
（1）将GST-MTV1（诱饵）和GST（阴性对照）表达菌的单个菌落（或保存的甘油菌种），在10mL LB中过夜培养，并选择适当的抗生素（在本例中，抗生素为100μg/mL羧苄青霉素）。使用50mL离心管，在37℃震荡培养箱中培养，转速至少为200rpm。离心管道不应完全封闭，以允许气体交换。
（2）次日，准备两个锥型烧瓶（体积500mL），每个烧瓶中加入150mL LB 100μg/mL羧苄青霉素，接着，分别加入MTV1-GST和GST预培养物。在25℃的摇床中培养、转速至少200rpm，直到OD600值达到0.6。细菌在25℃下生长有助于产生可溶性的蛋白质。
（3）为了诱导GST-MTV1和GST的表达，添加IPTG至最终浓度为1mM，在25℃下继续培养3-4h。
（4）将每种培养物放入3个50mL的离心管中，在4℃、3000×g的条件下离心5min。
（5）弃掉上清液，用冷的PBS重悬沉淀物，然后如上所示再次离心。
（6）弃掉上清液，将沉淀物储存在-80℃。沉淀物可以储存几个星期。在一个pull-down实验中，只使用其中一个沉淀物（对应于50mL的细菌培养）。
3. 从细菌中提取蛋白质
（1）取GST-MTV1和GST沉淀物（对应50mL细菌培养物），分别在2.5mL冷的提取缓冲液中重悬。
（2）使用超声破壁仪破坏细菌细胞，直到它们被溶解，呈现为不透明度降低和黏度增加。该操作必须在冰上进行，并且建议每隔一段时间进行超声一次（例如超声10s，然后在冰上放置10s，以此类推）。必须注意不要使用高强度的声波。如果检测到起泡或形成白色沉淀，则需要降低超声强度。
（3）将溶解的菌液转移到1.5mL离心管中，在4℃，16000×g的条件下离心20min。
4. 重组谷胱甘肽琼脂糖珠
（1）重组谷胱甘肽琼脂糖珠。对于每个GST-MTV1和GST，称10mg干珠，并加入2mL洗涤缓冲液。让珠子膨胀10min，同时偶尔旋转。
（2）将浆液装入两个Poly-Prep柱上，将它们垂直放置在适当的支架上，让缓冲液通过底部开口通过重力排出。不要使用离心机或真空来增加流量。这适用于后续所有洗涤步骤。
（3）然后用10mL洗涤缓冲液清洗柱子，并通过重力排出。
5. 蛋白与谷胱甘肽珠结合
在离心的细菌裂解液中，取150μL上清液，与75μL样品装载缓冲液混合，煮沸5min，-20℃保存，作为对照。检查细菌裂解后的蛋白质表达和完整性，例如使用抗GST抗体进行免疫印迹分析。其余的上清装入色谱柱，一个用于GST-MTV1，一个用于GST。如果裂解液粘度过高，可以加入1-2mL提取缓冲液。关闭柱子里面和外面的出口，并将其放置在4°C的旋转轮上2h。将裂解液通过重力沥干，用10mL洗涤缓冲液在4℃下洗涤3次。
6. 植物提取物
（1）用纸巾将水培培养的拟南芥幼苗吸干。称取0.7g，然后转移到研钵中。
（2）加入液氮冷冻，然后用研棒磨成细粉。
（3）加入4mL提取缓冲液，慢慢解冻，然后进一步研磨。
（4）将样品转移到1.5mL的离心管中，在16000×g，4℃条件下离心20min。
（5）将上清液通过0.20μm的过滤注射器进行过滤，将提取液冷藏。每个柱子需要1mL提取液。
7. Pull-down
（1）关闭柱子的出口。
（2）对于每根柱子，将1mL提取液与1mL提取缓冲液混合，并加入到洗涤柱中。
（3）关闭柱子的入口，并将其置于4℃的旋转轮上1.5h。
（4）然后打开柱子里面和外面的出口，并收集流出的混合液。
（5）将每个色谱柱中的流动液150μL与75μL的上样缓冲液混合，煮沸5min，保持在-20°C。这些样本是流动的，包含所有未结合的植物蛋白（通常还有一些细菌蛋白）。
（6）用10mL洗涤缓冲液在4℃条件下洗涤3次，通过重力沥干。
（7）珠子的体积现在约为100µL。关闭柱子的出口，在200µL洗涤缓冲液中重新悬浮珠子。
（8）取150μL的珠浆，加入75μL的样品上样缓冲液。将样品煮沸5min，用力混合，16000×g离心5min。
（9）将上清液放入新管中，放在-20℃下保存。这些样品分别含有与GST-MTV1或GST结合的蛋白质以及诱饵蛋白本身的洗脱物。
（10）一般情况下，流动样品和洗脱液样品相邻装载在GST和GST-MTV1的免疫印迹上（见图1）。通常建议纠正流动和洗脱液中不同的蛋白含量，一个好的起始量是加载5µL流动液和20µL洗脱液，但这必须通过经验来确定。
图1 免疫印迹显示抗网格蛋白重链（CHC）抗体的典型结果（约190kDA）。在GST和GST-MTV1的流动液（FT）中均检测到该蛋白，表明CHC在孵育过程中以相同的水平存在。洗涤后，只有GST-MTV1的洗脱液（EL）产生信号，表明CHC与MTV1特异性结合。在本印迹中，装载5µL FT样品和20µL EL样品以补偿不同的蛋白水平。
（11）在两种流动样品中都能检测到与GST-MTV1特异性结合的蛋白，但只在GST-MTV1洗脱样品中检测到。以网格蛋白重链（CHC）为例，可以使用一种商业抗CHC抗体检测（见图1）。
（12）在两种洗脱液样品中检测到的蛋白质与GST标签或谷胱甘肽-琼脂糖基质非特异性结合。这种情况会增加洗涤步骤的时间和数量，因此可以从步骤6开始使用不同的盐或洗涤液进行洗涤。
注：（1）该实验方法理论上可以用于任何一种可以融合到GST标签上的蛋白质。不过，可能需要针对每个特定情况进行优化。MTV1是一种易在大肠杆菌中表达的可溶性蛋白，不需要真核生物翻译后修饰，如糖基化。其他的蛋白质可能需要不同的表达和缓冲体系。
（2）PMSF是剧毒的，在水溶液中非常不稳定，所以制备时必须小心。常见的做法是在甲醇中制备200mM原液，在-20°C下可以储存至少半年。
（3）价格昂贵的羧苄青霉素可以用相同浓度的氨苄青霉素代替。但氨苄青霉素的稳定性较差，故首选羧苄青霉素。
（4）完全抑制剂以片状的形式出现，每片可以用于最终体积为50mL的缓冲液。如果需要更小的体积，片剂可以溶解在1mL水中，产生50×的原液，剩余原液可以在-20°C下保存几周，而不会急剧地失去活性。
配方
1. 水培培养的拟南芥幼苗
（1）200-300个拟南芥种子（我们使用Col-0系，也可以是任何株系、突变体或转基因株系）。在1.5mL离心管中用70%乙醇浸泡15min，偶尔涡旋。
（2）在超净工作台中，用1mL无菌水清洗种子5次。最后一次清洗后，将种子放在水中，盖紧离心管，在黑暗4°C 条件下放置2-3天进行分层。
（3）将分层后的种子放入装有100mL MS培养基的250mL锥型烧瓶中，在植物生长室中轻轻搅拌（如50rpm的摇床）。采用16h光照/8h黑暗，在24℃的生长条件下，生长6-8天。
2. MS培养基（1L）
2.45g MS培养基与维生素和MES缓冲液混合
10g蔗糖
添加无菌水至1L
用KOH将pH调至5.8
3. PBS（1L）
8g NaCl
0.2g KCl
1.44g Na2HPO4
0.24g KH2PO4
溶于800mL无菌水
用HCl将pH调至7.4
最后定容至1L
4. 清洗缓冲液
PBS
0.5% Triton X-100
0.5mM PMSF（由200mM PMSF甲醇原液制成）
5. 提取缓冲液
类似于清洗缓冲液，但添加了1×的完全抑制剂
6. 上样缓冲液（50mL）
15ml 20% SDS水溶液
15mL甘油
15mL 0.5M Tris溶液（pH=6.8）
1.25mL无菌水
少量溴酚蓝，刚好足以提供中等蓝色的颜色。
使用前，每925μL缓冲液中加入75μL β-巯基乙醇。
7. LB培养基（1L）
10g胰蛋白胨
5g酵母粉
10g NaCl
加入1L的无菌水
在121℃下高压灭菌15min
References：
Sauer M. Delgadillo M. O. Zouhar J. Reynolds G. D. Pennington J. G. Jiang L. Liljegren S. J. Stierhof Y. D. De Jaeger G. Otegui M. S. Bednarek S. Y. and Rojo E. (2013). MTV1 and MTV4 encode plant-specific ENTH and ARF GAP proteins that mediate clathrin-dependent trafficking of vacuolar cargo from the trans-Golgi network. Plant Cell 25(6): 2217-2235.
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