巨噬细胞来源于骨髓样前体细胞：草酸钙将人单核细胞分化为炎性M1巨噬细胞
巨噬细胞来源于骨髓样前体细胞：草酸钙将人单核细胞分化为炎性M1巨噬细胞组织巨噬细胞在体内平衡中起重要而复杂的作用，调节免疫，炎症和血管生成，同时清除凋亡细胞（11）.我们已经在体外证明，人巨噬细胞能够吞噬，吞噬并逐渐分解CaOx晶体和人结石碎片（12）。这些活化的巨噬细胞释放一系列细胞因子和趋化因子，旨在将循环的单核细胞吸引到组织炎症部位。单核细胞和巨噬细胞与人类和啮齿动物模型中的CaOx结石病有关（13-16）。高氧草酸C57BL / 6J小鼠表达M-CSF和CCL2，其可能潜在地招募单核细胞（14）;与接受M2巨噬细胞输血的小鼠相比，接受M1巨噬细胞输注的高氧汞C57BL / 6J小鼠显示出IL-6和TNFα的CaOx产生增加（15）。此外，M-CSF缺乏小鼠在肾脏中的CaOx沉积显着高于野生型小鼠（16）。此外，Okada等人报告说，在60名接受肾癌根治性肾切除术的患者中，CD68（ ）巨噬细胞总体增加，这些患者随后被追溯性地归类为结石形成者（13）。
Dominguez-Gutierrez PR Kusmartsev S Canales BK Khan SR. Calcium Oxalate Differentiates Human Monocytes Into Inflammatory M1 Macrophages. Front Immunol. 2018 Aug 22;9:1863. doi: 10.3389/fimmu.2018.01863. PMID: 30186283; PMCID: PMC6113402.
许多高氧草酸状态与肾脏中的草酸钙（CaOx）沉积物有关。在结石病的动物模型中，这些晶体与作为先天免疫的一部分迁移到肾脏中的循环单核细胞相互作用。同样，巨噬细胞在排泄高水平草酸盐的患者的肾脏中包围CaOx晶体。我们研究了这种暴露的影响以及随后的体外人类免疫反应。
材料和方法
从健康供体中收集原代人单核细胞，并暴露于CaOx，草酸钾和草酸锌（ZnOx）。用多重ELISA测量细胞因子的产生。进行定量逆转录-聚合酶链反应以验证mRNA谱表达。M1巨噬细胞表型用免疫荧光显微镜检查证实。
结果
原代单核细胞和THP-1细胞（一种人单核细胞系）都以剂量依赖性方式对CaOx晶体有强烈反应，产生TNF-α，IL-1β，IL-8和IL-10转录本。与单独使用LPS相比，暴露于CaOx后用LPS进行1小时对细胞因子产生具有加性效应，然而，LPS随后的CaOx导致细胞因子产生显着降低。从单核细胞中提取的上清液先前暴露于CaOx晶体可增强M2巨噬细胞晶体的吞噬作用。CaOx，但不是钾或ZnOx，促进单核细胞分化成炎性M1样巨噬细胞。
结论
在我们的体外实验中，人类单核细胞被CaOx激活并产生炎症细胞因子。单核细胞通过一种特定的机制识别CaOx晶体，这种机制可以增强或减少对LPS的先天免疫反应。CaOx促进了M1巨噬细胞的发育。这些结果表明，单核细胞具有促进CaOx诱导的炎症的重要作用。
关键词： 肾结石， 草酸钙， 单核细胞， 巨噬细胞， 炎性细胞因子， 肾结石
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介绍
各种晶体可以在肾脏内形成和积聚。这些沉积物最终可导致肾结石，这是一种痛苦的情况，在世界各地越来越普遍和昂贵（1，2）。草酸钙 （CaOx） 晶体是最常见的肾结石的主要成分，这些肾结石最初是内髓质收集管内的沉积物或塞子，或磷酸钙在肾上的上皮下沉积物，其中包括尿草酸水平高或高草酸尿症（3-7），这在原发性高草酸尿症患者中最常见。在啮齿动物中，高草酸尿症导致CaOx在肾近端肾小管腔内的快速结晶（8，9）。虽然大多数CaOx晶体随滤液一起通过肾单位移动，但一些晶体仍然附着在肾小管上皮细胞上，并且似乎迁移到肾间质中。随着时间的推移，这些晶体被包围，吞没，并最终被组织巨噬细胞清除，具有最小的可见炎症变化。类似地，田口等人最近通过肾状尖端组织活检证明，人CaOx结石形成剂具有大量的组织炎症标志物，但可见的炎症变化最小，这表明低级别肾免疫反应确实发生在CaOx结石形成物中（10）。
组织巨噬细胞在体内平衡中起重要而复杂的作用，调节免疫，炎症和血管生成，同时清除凋亡细胞（11）.我们已经在体外证明，人巨噬细胞能够吞噬，吞噬并逐渐分解CaOx晶体和人结石碎片（12）。这些活化的巨噬细胞释放一系列细胞因子和趋化因子，旨在将循环的单核细胞吸引到组织炎症部位。单核细胞和巨噬细胞与人类和啮齿动物模型中的CaOx结石病有关（13-16）。高氧草酸C57BL / 6J小鼠表达M-CSF和CCL2，其可能潜在地招募单核细胞（14）;与接受M2巨噬细胞输血的小鼠相比，接受M1巨噬细胞输注的高氧汞C57BL / 6J小鼠显示出IL-6和TNFα的CaOx产生增加（15）。此外，M-CSF缺乏小鼠在肾脏中的CaOx沉积显着高于野生型小鼠（16）。此外，Okada等人报告说，在60名接受肾癌根治性肾切除术的患者中，CD68（ ）巨噬细胞总体增加，这些患者随后被追溯性地归类为结石形成者（13）。此外，Williams等人证明，与健康供体相比，从CaOx结石形成者（n= 12）的外周血中分离的单核细胞显示出显着较低的线粒体最大呼吸，储备能力和生物能量健康指数（17）。为了进一步了解这些免疫反应，我们将原代人类单核细胞和单核细胞系（THP-1细胞）暴露于可溶性草酸盐，CaOx晶体以及各种其他矿物质和对照中，以确定反应，时间依赖性效应以及炎症细胞因子和趋化因子的产生。
材料和方法
试剂和培养基
超纯99.999%煤氧化物（阿尔法埃莎），草酸钾（K2从西格玛奥德里奇购买了氧化锌（ZnOx）和200纳米或更小的羟基磷灰石（HA）晶体。来自肠道链球菌血清型明尼苏达州Re595（LPS Se，TLR4配体，超纯级，西格玛 - 奥尔德里奇）的500-1，000 ng / ml LPS被用作先天免疫刺激的阳性对照（18-21）。使用补充10%胎牛血清，20mM HEPES，20mM丙酮酸钠和100 U / ml青霉素 - 链霉素的RPMI 1640培养基进行体外实验（海克隆实验室，犹他州洛根）。
细胞培养
人单核细胞系THP-1细胞是从美国型培养集合（ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯，美国）获得的。为了在体外分析THP-1单核细胞对晶体的反应，在1×10接种对数相细胞6细胞/ ml在24孔板中。
原代人单核细胞的制备
在机构审查委员会批准后，从LifeSouth社区血液中心（美国佛罗里达州盖恩斯维尔）获得了没有人口统计数据的人类巴菲大衣样本。外周血单核细胞（PBMC）根据制造商的建议通过淋巴准备（Accu-Prep，1.077 g / ml，挪威奥斯陆）梯度密度离心分离。用10ml PBS洗涤PBMC两次，并使用ACK裂解缓冲液裂解红细胞（生物惠特克，马里兰州沃克斯维尔，美国）。根据制造商的说明，使用MACS方法（米尔滕伊生物技术，德国贝尔吉施格拉德巴赫）从PBMC纯化单核细胞。简而言之，将细胞与与抗CD14偶联的珠子一起孵育，并使用LS柱（Miltenyi Biotec）进行阳性选择。95%的回收细胞表达单核细胞标志物CD14。
原代人巨噬细胞的制备
细胞因子诱导的分化
单核细胞通过接种在24孔培养板（1×10）中，在6天内分化为巨噬细胞6细胞/毫升）在完全RPMI 1640培养基中，并在第0天和第3天用20ng / ml重组人M-CSF或重组人GM-CSF处理。
煤氧化物诱导的分化
将单核细胞接种在24孔培养板（1×106细胞/毫升）在完整的RPMI 1640培养基中，暴露于0.05毫升（64.0微克/毫升）或2.5毫升（320微克/毫升）的CaOx中。
使用Qdot525标记的CaOx进行吞噬作用测定
用2.5 mM CaOx，HA或PBS作为对照刺激原代人单核细胞18小时。收集上清液并离心以沉淀任何矿物质，细胞和碎片。将干净的上清液冷冻在−80°C。 如上所述，自体单核细胞分化为M2巨噬细胞。在第6天，取出培养基，并加入来自单核细胞处理的一半新鲜培养基和一半上清液的溶液。8小时后，加入1.56mM（200mg / ml）Qdot 525标记的CaOx。1小时后，用PBS洗涤巨噬细胞三次以除去任何细胞外CaOx。CaOx根据修改后的制造商协议用Qdot 525氨基量子点（Qdot525，应用生物系统）标记。将100μlQdot525与1.0ml硼酸盐缓冲液和0.5ml 2.50mM（320μg/ ml）CaOx混合在10nM硼酸盐缓冲液中。在 4oC，将10μl10mg / ml 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（赛默飞世尔科学，马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国）加入上述物中并孵育1分钟。孵育后，用PBS洗涤Qdot525-CaOx三次，沉淀并重悬于1ml新鲜培养基中。在20×放大倍率下，EVOS FL细胞成像系统（应用生物系统）评估了CaOx晶体的细胞间摄取。使用photok视觉确定Qdot 525标记的CaOx阳性巨噬细胞。N = 每个治疗组的3。
免疫荧光和血红素瘤3巨噬细胞染色
用4%多聚甲醛和1%戊二醛固定巨噬细胞10分钟。随后用2%BSA冲洗和阻断巨噬细胞，用M1标记物CD68（阿博姆ab955）和CD86（阿博康，ab53004）和M2标志物CD163（阿博姆，ab87099），CD206（艾康，ab8918）和磷酸化STAT6（阿博康，ab28829）的一抗染色巨噬细胞。二抗染色是用Alexa Fluor 488，山羊抗小鼠IgG（阿博姆，ab150113）和Cy5以及山羊抗兔IgG（阿卡姆，ab6563）完成的。方案Hema 3染色系统（费雪科学）用于根据制造商的方案对巨噬细胞形态进行染色。
定量实时荧光定量 PCR
根据制造商的说明，使用直接佐尔RNA迷你准备（Zymo研究）从单核细胞中分离出总细胞RNA。在协同H1平板读数仪（生物保健科技）上使用Take3平板测量RNA浓度。每个RNA样品的cDNA按照制造商的方案使用高容量cDNA逆转录试剂盒（应用生物系统）在20μl反应中合成。qPCR分析使用7900HT快速实时荧光定量PCR系统（应用生物系统）进行。在这项研究中使用了来自应用生物系统的人TNFα（测定ID：Hs01113624_g1），IL-1β（测定ID：Hs01555410_m1），IL-6（测定ID：Hs00985639_m1），IL-8（测定ID：Hs00174103_m1）和CCL2（测定ID：Hs00234140_m1）的cDNA特异性TaqMan基因表达测定。使用真核生物18s rRNA（测定ID：4319413E）作为内源性对照。mRNA的相对表达由ΔΔC测定T方法，其中循环阈值 （CT）确定mRNA表达相对于未处理的对照的值。
多重细胞因子酶联免疫吸附测定
将无细胞培养物上清液样品储存在−20°C直至分析。所使用的系统是由中观规模发现公司（MSD，马里兰州盖瑟斯堡，美国）制造的多重ELISA测定，每孔含有10个单独的ELISA。根据制造商的建议，使用U-PLEX促炎小组1人试剂盒[一种基于多重96孔ELISA板的测定，含有针对IL-12，IL-10，TNFα，IL-6，IL22，白细胞介素1受体拮抗剂（IL-1Ra），干扰素α2a（IFNα2a），干扰素β（IFNβ），干扰素γ（IFNγ）和IL-1β的一抗]进行测试。简而言之，MSD丛测定按如下方式运行。在提供的用于人血清的测定稀释剂中制备校准曲线，范围为40，000-1.2 pg / ml，具体取决于细胞因子。将阵列用每孔25μl测定稀释剂预孵育30分钟。预孵育后，将25μl样品或校准品一式两份加入到适当的孔中。然后将该阵列与一抗一起在室温下孵育2小时。用PBS加0.05%吐温20洗涤阵列，并加入25μl检测抗体试剂。与二抗在室温下孵育2小时后，洗涤阵列，并加入检测缓冲液。使用快速复合SQ 120读取结果。使用MSD发现工作台4.0软件测定样品细胞因子浓度。
数据分析
分析使用JMP Pro版本10（SAS，卡里，北卡罗来纳州，美国）进行。邓内特与控制和图基 - 克莱默诚实显着差异测试用于评估显着性。P值小于0.05被认为是显著的。
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结果
CaOx刺激THP-1细胞中炎症细胞因子的产生
将人单核细胞THP-1细胞暴露于100，10和1×剂量的CaOx逐渐减少（图1 ，蓝色条）， K2牛（图1、灰色条）或 HA（图1，橙色条）在8小时的时间内。当暴露于CaOx晶体时，THP-1细胞以时间和剂量依赖性方式上调TNFα，IL-1β，IL-8，IL-10，IL-23和CCL2（单核细胞趋化蛋白-1 / MCP-1）的表达（第0.05页）（第0.05 <页）（图1、蓝色条）。然而，THP-1细胞对可溶性K没有显示出剂量依赖性反应2Ox 并表现出相当适度的时间依赖性响应（图1、灰色条形）。HA未能刺激显着的免疫反应（图1，橙色条）。
图 1
草酸钙（CaOx）在人单核细胞THP-1细胞系中诱导炎症细胞因子的剂量和时间依赖性表达。用摩尔100×（7.81微米，1，000微克/毫升），10×（0.78毫升，100.0微克/毫升）和1×（0.078毫升，10.0微克/毫升）钙氧化物（蓝色）处理THP-1细胞;100×（6.84毫升，1，138微克/毫升），10×（0.68毫升，113.8微克/毫升）和1×（0.068毫升，11.4微克/毫升）草酸钾（灰色，K2牛）;100×（1.99毫升，1，000微克/毫升），10×（0.20毫升，100.0微克/毫升）和1×（0.020毫升，10.0微克/毫升）羟基磷灰石（橙，HA）;或未经处理的控件（红色、UTx）。处理后，将细胞孵育2，4或8小时。从各自的细胞沉淀中纯化总RNA，并通过定量实时荧光定量PCR分析TNFα（A），IL-1β（B），IL-8（C），IL-10（D），IL-23（E）和CCL2（F）的相对折叠表达。将mRNA表达分别用18sRNA归一化。所有结果都表示为来自四个独立实验的相对折叠变化单位（RFU）±SD。*p< 0.05，与 UTx 相比。
原发性人单核细胞对CaOx有反应，但对透明质酸无反应
用CaOx处理原发性人单核细胞（图2，蓝条）并测定表达变化。用CaOx处理的单核细胞中TNFα，IL-1β，IL-6，IL-8和CCL2显着增加（p<0.05）;但是，HA（图2，橙色条）没有显着影响。LPS（灰色条）和PBS（UTx，红色条）分别用作阳性和阴性对照（图2).
图 2
草酸钙（CaOx）而不是羟基磷灰石（HA）以时间依赖性方式刺激原代人单核细胞中的促炎细胞因子表达。用1.95mM（250μg/ ml）CaOx（蓝色），0.40mM（200μg/ ml）HA（橙色），1μg/ ml LPS（灰色，阳性对照）和UTx（红色，未处理）处理原代人单核细胞并孵育2，4，8或18小时。从各自的细胞沉淀中纯化总RNA，并通过定量实时荧光定量PCR分析TNFα（A），IL-1β（B），IL-6（C），IL-8（D）和CCL2（E）的相对折叠表达。将mRNA表达分别用18sRNA归一化。所有结果都表示为来自四个独立实验的相对折叠变化单位（RFU）±SD。*p< 0.05，与 UTx 相比。
氧化钙改变单核细胞对LPS暴露的反应
暴露于LPS的原发性人单核细胞，随后1 h后由CaOx照射（图3，灰条）显示TNFα，IL-1β，IL-8和CCL2显着降低（p<0.05）（图3A、B、D、E） 与单独使用液化石油标准相比 （图3、红色条形）和氧化钙，然后是 LPS 暴露（图3，橙色条）。此外，CaOx随后的LPS（橙色）暴露显示出这些细胞因子和趋化因子的表达水平显着高于单独的LPS（第0.05页<）（图3红条）。IL-6似乎主要由LPS驱动;然而，与其他LPS暴露相比，CaOx随后的LPS暴露似乎具有延迟的IL-6反应（图3C).
图 3
草酸钙 （CaOx） 根据暴露顺序上调或下调单核细胞对 LPS 的反应中的炎性细胞因子表达。将原代人单核细胞与500ng / ml LPS，1.95mM（250μg/ ml）CaOx或PBS一起孵育1小时。孵育后，将单核细胞分别暴露于1.95 mM CaOx（灰色），500ng / ml LPS（橙色）或500ng / ml LPS（红色）中，并孵育2，4，8或18小时。未经处理的样品（UTx，绿色）仅在两次孵育中都获得了PBS。从各自的细胞沉淀中纯化总RNA，并通过定量实时荧光定量PCR分析TNFα（A），IL-1β（B），IL-6（C），IL-8（D）和CCL2（E）的相对折叠表达。将mRNA表达分别用18sRNA归一化。所有结果都表示为来自四个独立实验的相对折叠变化单位（RFU）±SD。图基-克莱默诚实显著差异检验用于确定多重比较的显著性。
暴露于氧化钙的单核细胞增强型 M2 巨噬细胞对氧化钙晶体的摄取
原代人单核细胞暴露于CaOx，HA或未经治疗（UTx）24小时。匹配的供体原代单核细胞分化为M2巨噬细胞和M-CSF。在CaOx暴露前2小时将培养物上清液转移给原代人M2巨噬细胞的匹配供体（图4).在暴露后1小时内，用CaOx处理的上清液预处理的巨噬细胞（79.0±2.30%）比用HA处理的上清液预处理的巨噬细胞（17.6±3.50%，p< 0.0001）或UTx（9.70±2.31%，p<0.0001）单核细胞（图4).
图 4
CaOx刺激单核细胞以增强M2巨噬细胞对CaOx的摄取。（A）原代单核细胞用M-CSF处理6天，分化成M2巨噬细胞。将供体匹配的单核细胞暴露于2.50mM草酸钙（CaOx），羟基磷灰石（HA）或未经处理（UTx，PBS）并孵育24小时。将来自单核细胞的上清液转移到M2巨噬细胞中并孵育2小时。2 h后，巨噬细胞暴露于1.56 mM Qdot525标记的CaOx中，并在1 h后用Evos FL自动显微镜GFP光立方对摄取进行成像。（B）暴露于CaOx上清液的巨噬细胞中有79.0±2.30%的巨噬细胞具有吞噬性Qdot525标记CaOx，而暴露于HA上清液的巨噬细胞为17.6±3.50%（第<0.0001页）和9.70±2.31%的UTx（第<0.0001页）。图像在20×放大倍率下代表n= 3。
巨噬细胞分化对CaOx具有特异性，而不是对K2牛或氧化锌
原代人类单核细胞在6天内暴露于CaOx。在CaOx暴露的第3天，用HEMA 3染色的单核细胞显示出类似于GM-CSF处理的单核细胞的巨噬细胞样形态（图5A）.为了验证CaOx的特异性，将原代单核细胞暴露于CaOx，K2牛，或氧化锌在6天内（图5ZnOx没有诱导原代单核细胞的分化;然而，一些单核细胞在暴露于K时显示出巨噬细胞样形态2牛（图5B. K2牛和UTx显示出最少数量的巨噬细胞。M-脑脊液和转基因脑脊液诱导的巨噬细胞是阳性对照，分别形成M2和M1巨噬细胞。
图 5
草酸钙（CaOx）在3天内诱导巨噬细胞样形态。（A）原代单核细胞暴露于1.0，2.0或3.0mM CaOx或20ng / ml M-CSF中3天。第3天后，用HEMA 3试剂盒染色细胞以进行巨噬细胞形态学。（B）. 原代人单核细胞暴露于0.50或1.00 mM的CaOx，草酸钾（K2牛），或草酸锌（ZnOx）并孵育6天。图像在20×放大倍率下代表n= 3。
CaOx诱导炎性M1样巨噬细胞分化和细胞因子/趋化因子的产生
原代人类单核细胞在6天内再次暴露于CaOx。M-脑脊液和转基因脑脊液诱导的巨噬细胞为阳性对照组，分别形成M2和M1巨噬细胞。CaOx分化的巨噬细胞和转基因脑脊液诱导的（M1）巨噬细胞分别为CD86和CD68双阳性，而M-CSF诱导的巨噬细胞为双阴性（图6巨噬细胞也被双重染色为CD163和CD68或CD206（甘露糖受体）和磷酸化（p）STAT6。CaOx诱导和转基因脑脊液诱导的巨噬细胞CD163，CD206和pSTAT6均为阴性;然而，M-CSF诱导巨噬细胞，其中所有三个标志物均呈阳性（图6B;补充材料中的图S1）。
图 6
草酸钙（CaOx）诱导单核细胞分化成炎症性（M1）巨噬细胞。将原代单核细胞暴露于1.95 mM CaOx，20ng / ml M-CSF（M2对照）或GM-CSF（M1对照）中并孵育6天。（A）第6天后，用兔抗CD86（绿色）和小鼠抗CD68（红色）（40×，条，100μm）或（B）用兔抗CD163（绿色）和小鼠抗CD68（红色）（20×，酒吧，200μm）双重染色细胞。原子核被4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）复染。N = 3。
CaOx诱导的巨噬细胞产生M1样巨噬细胞因子和趋化因子谱
与LPS处理后的M-CSF诱导巨噬细胞相比，CaOx（p= 0.0051）和GM-CSF（第<0.0001页）诱导的巨噬细胞的M1标志物IL-12显着更高;与M-CSF诱导相比，CaOx（p<0.0001）和GM-CSF（p<0.0001）诱导的M2标记IL-10均显著降低（图7A，B）。暴露于LPS后，与M-CSF诱导的巨噬细胞相比，CaOx和GM-CSF诱导的巨噬细胞的TNFα（p= 0.0002，p<0.0001）和CCL22（p<0.0001，p<0.0001）显着升高，但IL-6的TNFα（p= 0.0001，p<0.0001），IFNα2a（p= 0.0003，p= 0.0027）和IFNβ（p<0.0001，p<0.0001）显着降低（p<0.0001，p<0.0001）（ 图7C，E–H）。对于PBS对照，在CaOx和GM-CSF诱导的巨噬细胞中，CCL22（p= 0.0007，p<0.0001）和IL-1Ra（第<0.0001页，第<页0.0001）显著升高（图7D，E）。INFγ（第<页0.0001）在LPS刺激的转基因脑脊液诱导巨噬细胞中显着升高（图7IL-1β （p= 0.0055） 在LPS刺激的CaOx诱导巨噬细胞中显着降低（图7J).
图 7
用LPS刺激后草酸钙（CaOx）诱导的炎症（M1）巨噬细胞的细胞因子谱。将原代单核细胞暴露于1.95 mM CaOx，20ng / ml M-CSF（M2对照）或GM-CSF（M1对照）中并孵育6天。在第6天，巨噬细胞暴露于1μg/ ml LPS或PBS（对照）并孵育24小时。在24 h收集上清液，并使用中观尺度发现U-Plex （10多重）ELISA分析IL-12（A），IL-10（B），TNFα（C），IL-6（D），IL22（E），白细胞介素1受体拮抗剂（F），干扰素α2a（G），干扰素β（H），干扰素γ（I）和IL-1β（J）蛋白分析。所有结果均以pg / ml表示，±来自四个独立实验的SD。*p< 0.05，与M-脑脊液相比。
讨论
由于这项研究试图在体外模拟晶体和免疫细胞的相互作用，因此对我们的方法进行批判性评估非常重要。首先，为了标准化不同矿物类型之间草酸盐的暴露，使用了摩尔浓度。因为曹氧2O4） 和 K2牛 （K2C2O4）分子量不同，1，000微克/毫升的CaOx含有比1，000微克/毫升K更多的草酸盐分子2牛。因此，使用CaOx和K实现7.81 mM草酸盐2牛，更多K2牛（1，438微克/毫升）比卡奥（1，000微克/毫升）需要。其次，为了控制钙分子，使用摩尔浓度（每单位体积的钙摩尔数）。例如，1 毫微米哈 （HCa5O13P3） 的钙原子数是 1 mM 钙氧化物 （CaC） 的五倍2O4).因此，实验和对照之间的浓度变化是试图控制矿物质浓度，因此在可能的情况下使用mM和mg / ml值。
草酸盐的生物水平根据生物体液而变化。正常个体的血清草酸盐范围为0.2至10μmol/l，肾功能衰竭的血清草酸盐高达89μmol/升（5，22-24）。对于1型原发性高草酸尿症患儿，据报道血清水平为125.7μmol/l（25）。在41名健康男性和40名女性的唾液中，据报道草酸盐的范围分别为0.10±0.09和0.18±0.17μM（26）。据报道，牙垢中的草酸盐为3.3±1.2毫摩尔/千克牙垢（26）。在尿液中，正常人每天排泄0.222-0.444毫摩尔（20-40毫克）的草酸盐;然而，对于原发性高草酸尿症的个体，尿草酸盐排泄量为每天1.5-3.0毫摩尔（135-270毫克）（27）。为了确定单核细胞对草酸盐的最佳反应，我们测试了从高达7.81 mM（1，000μg/ ml）到0.50mM（64.0μg/ ml）CaOx的范围。
在我们的体外模型中，CaOx晶体刺激TNFα，IL-1β，IL-6，IL-8和CCL2的显着，精细调节，剂量和时间依赖性释放（图1和2）来自人单核细胞和THP-1细胞，类似于LPS或肽聚糖暴露后看到的先天免疫反应（18，28，29）。与Williams等人的结果（17）一致，我们还证明了IL-6在原代人单核细胞中的表达（图2C，蓝色条）。THP-1细胞表达IL-23和IL-10;然而，原代人单核细胞不表达IL-23和IL-10。THP-1细胞是一种人单核细胞系，来源于患有急性单核细胞白血病的1岁男性（30）。虽然它们与原代单核细胞相似，但它们的反应可能不同。辛提普龙拉特等人报道了当暴露于CaOx时U937人单核细胞表达IFNα（31）。然而，THP-1细胞和原代人单核细胞不表达可以通过qPCR检测到的IFNα，IFNβ和IFNγ（数据未显示）。将 THP-1 细胞暴露于 K2Ox 未引起响应（图1，灰色条），但随着时间的推移，K2氧化沉淀形成氧化钙（图5B），这可能是使用10×浓度注意到的小THP-1反应的原因（图1、灰色条形）。HA在THP1细胞中引起无反应（图1和2，橙色条）。同样，两者都不是K2与CaOx相比，氧化和氧化锌都驱动巨噬细胞分化（图5);似乎人类单核细胞识别CaOx晶体，但不能识别草酸盐或羟基磷灰石。除IL-6外，细胞因子TNFα和IL-1β以及趋化因子IL-8和CCL2具有截然不同的反应，这取决于原代人单核细胞是否首先遇到CaOx或LPS。暴露于钙氧化物的单核细胞随后出现低磷脂蛋白（氧化钙-低烟酸，图3，橙色条）显示比单独LPS更大的响应（图3，红条），表明由CaOx引起的氧化应激增强单核细胞中的toll样受体4激活（32，33）。然而，相反的结果会导致不可预测的反应：单核细胞暴露于LPS，然后是CaOx（LPS-CaOx，图）3，灰色条）显示细胞因子和趋化因子的表达与CaOx和LPS相比降低（图3、橙色条）或单独使用 LPS（图3、红色条）。这种类型的反应类似于LPS耐受性，其中低剂量的LPS暴露减弱了对较高剂量的LPS（18，28，29）的后续反应。Li等人报告说，钙传感受体（CaSR）识别HK-2细胞中的CaOx并促进大鼠肾脏中的晶体粘附（34）。Kelly等人报告说，当小鼠腹膜巨噬细胞预先暴露于钙时，CaSR抑制了小鼠腹膜巨噬细胞中NFκB和TNFα分泌的LPS活化（35）。然而，我们观察到相反的效果降低，其中单核细胞预先暴露于LPS，然后是CaOx（LPS-CaOx）。当我们将原代人单核细胞暴露于HA并随后暴露于LPS时，细胞因子和趋化因子表达不受影响（数据未显示）。这可能是由于CaSR仅识别钙离子。CaOx 和 HA 高度不溶，溶解度产物常数 （Ksp） 为 2.7 × 10−10和 1 × 10−34分别。CaOx可以作为一种“二元开关”，以相同的信号触发两种不同的细胞内通路。当单核细胞单独暴露于尿酸单钠（MSU）晶体（通过NALP3的炎症途径）或在死细胞存在下暴露于MSU晶体（通过Clec12a的无菌炎症途径）时，已经报道了这种现象（36）。这种独特的反应可能在肠道中起重要作用。肠道承受着LPS的持续负担和CaOx的周期性负担。菠菜等食物含有400-900毫克草酸盐;例如，据报道，100克新西兰菠菜含有736毫克可溶性草酸盐和220毫克CaOx（37-39）。吸收的大部分草酸盐在尿液中排泄，但10%或更少分泌回肠道（40）。LPS-CaOx反应将模拟当个体食用菠菜等食物时会发生什么，其中肠道不断暴露于LPS和其他细菌配体，并且仅定期暴露于大量的草酸盐中。LPS-CaOx反应在进化上是有益的。来自CaOx或CaOx-LPS的炎症反应将是有害的，并可能导致炎症性肠病。有趣的是，CaOx结石病与IBD高度相关。在我们的实验中，单核细胞通过产生炎性细胞因子（例如肿瘤坏死因子-α，IL-1β和IL-6）和趋化因子（例如CCL2）来对CaOx做出反应。这些信号激活并招募循环的单核细胞和组织巨噬细胞以促进CaOx清除（12）。与我们之前的工作一致，先前暴露于CaOx晶体的单核细胞的上清液增强了CaOx的M2巨噬细胞吞噬作用（图) (4 仅CaOx就使单核细胞分化为巨噬细胞（图5和6).因为两个 K 都不是2Ox和ZnOx都能够驱动分化，单核细胞可能利用优先识别CaOx晶体的受体。
草酸钙和GM-CSF（阳性对照）巨噬细胞M1巨噬细胞标志物CD68和CD86呈阳性，M2标志物CD163、CD206和pSTAT6阴性（图6一个;补充材料中的图S1）。当用LPS刺激时，钙氧化物和转基因-脑脊液产生促炎细胞因子IL-12（M1标志物）和TNFα（图7A，C）。无论LPS治疗如何，CCL22似乎都是M1标志物，并且通过转基因CSF和CaOx暴露而高度升高（图7与M-CSF诱导的巨噬细胞不同，CaOx和GM-CSF诱导的巨噬细胞对CD163（M2标记物）呈阴性（图6LPS刺激后，M-脑脊液诱导的巨噬细胞中IL-6、IFNα2a和IFNβ显著高于CaOx和转基因脑脊液诱导的巨噬细胞（图7F–H）。IL-1Ra是IL-1α和IL-1β的拮抗剂，并保护宿主免受内毒素诱导的损伤（44，45）。我们之前已经表明，IL-1Ra是由M2巨噬细胞分泌的，以响应CaOx和人CaOx肾结石（12）。钙氧化物，转基因脑脊液和M-脑脊液巨噬细胞表型通过产生IL-1Ra对LPS刺激作出反应;然而，与M-CSF诱导的巨噬细胞相比，未受刺激的CaOx和GM-CSF诱导的巨噬细胞中的IL-1ra显着升高（图7IFNγ似乎对LPS刺激的转基因脑脊液诱导的巨噬细胞具有特异性（图7总体而言，这些结果表明，CaOx诱导的巨噬细胞表现出M1巨噬细胞表型。
结论
人单核细胞和人单核细胞系以特定方式对CaOx晶体作出反应，引发局部组织炎症反应，驱动M1巨噬细胞分化。暴露于羟基磷灰石晶体或各种草酸盐对照后未观察到这种反应。单核细胞对LPS-CaOx和CaOx-LPS的独特和相反的反应似乎表明存在具有二元开关功能的CaOx受体，类似于MSU受体的描述。长期暴露于CaOx会诱导单核细胞分化成M1巨噬细胞。需要进一步研究信号传导机制。
