噬菌体一般是什么样子的？噬菌体展示原理及技术解析

噬菌体一般是什么样子的？噬菌体展示原理及技术解析三．噬菌体展示技术原理1985年Smith GP首次将外源基因插入到丝状噬菌体(Filamentous bacteriophage)的基因组中，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示到噬菌体的表面，从而创建了该项技术。噬菌体展示技术模拟了自然选择（如抗体亲和力成熟）的过程，可在短时间内实现对靶分子特异性受体的高通量筛选，同时将所筛选蛋白分子的基因型与表型完美的结合在了一起，极大地提高了筛选的效率噬菌体展示技术创建后就成为了生物学研究中的重要研究手段，从根本上改变了传统单克隆抗体制备流程（杂交瘤技术），被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等。随着技术的不断发展完善，还进化为多种展示技术，如核糖体展示、mRNA展示、细菌展示和酵母展示等。二．什么是噬菌体展示技术噬菌体展示技术（phage display）是利用基因重组的方法，将

一．噬菌体展示技术的发展

1985年Smith GP利用基因工程，将外源基因插入丝状噬菌体(Filamentous bacteriophage，fd)的基因组，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示，从而创建了噬菌体展示技术。

1990年，Mc Cafferty等利用噬菌体展示技术构建了库容为106的抗体库，使其成为一种新兴的抗体制备技术。

而Sir Gregory P. Winter是第一个利用噬菌体展示技术将鼠源抗体药物人源化，使得抗体药物用于临床治疗，比如Adalimumab。

噬菌体展示技术创建后就成为了生物学研究中的重要研究手段，从根本上改变了传统单克隆抗体制备流程（杂交瘤技术），被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等。随着技术的不断发展完善，还进化为多种展示技术，如核糖体展示、mRNA展示、细菌展示和酵母展示等。

二．什么是噬菌体展示技术

噬菌体展示技术（phage display）是利用基因重组的方法，将目标蛋白的基因重组到噬菌体衣壳蛋白的基因上，最终将目标蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面。

1985年Smith GP首次将外源基因插入到丝状噬菌体(Filamentous bacteriophage)的基因组中，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示到噬菌体的表面，从而创建了该项技术。噬菌体展示技术模拟了自然选择（如抗体亲和力成熟）的过程，可在短时间内实现对靶分子特异性受体的高通量筛选，同时将所筛选蛋白分子的基因型与表型完美的结合在了一起，极大地提高了筛选的效率

三．噬菌体展示技术原理

噬菌体展示技术（phage display）是将外源编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框能正确表达，使外源多肽或蛋白在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面，可以保持相对的空间结构和生物活性。

然后利用靶分子，采用合适的淘洗方法，洗去未特异性结合的噬菌体。再用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。

下图展示了噬菌体抗体库制备的简单过程：

1. 噬菌体展示技术关键及优势

噬菌体具有独特的优势，如特异性好、不易产生耐药性、增殖能力强、治疗副作用小、制备工艺简单、研发周期短、成本低廉等。

噬菌体展示技术的两大核心：建库和筛选

噬菌体建库：

从B淋巴细胞中扩增抗体的H链和L链基因文库，抗体片段群与噬菌体衣壳蛋白融合表达并展示于噬菌体表面，形成噬菌体展示抗体库。主要有三种类型： scFv库（由VH和VL组成，并由一个小肽（Gly4Ser）3连接成一个单链多肽）、Fab库（含有VH-CH，VL-CL，并由二硫键连接在一起）和VHH库（只有重链可变区）。

噬菌体展示肽库的构建途径：

目前主要有两种：一是有机合成法，二是基因合成法。前者是直接用固相肽合成技术，合成含有各种可能序列的短肽。基因工程方法是将编码各种序列特定长度短肽7的目的基因克隆进表达载体，与噬菌体的外壳蛋白基因融合表达，使得一个噬菌体上含有一种序列的肽。

噬菌体库的分类：

随机肽库：

将化学合成的随机寡核苷酸序列与噬菌体的表面蛋白基因融合，在噬菌体表面表达出各种氨基酸组合的随机序列短肽。利用噬菌体展示随机肽库可以高通量筛选各种抗原的抗原表位。

免疫库：

免疫库由经过免疫(包括疫苗注射、微生物感染、自身免疫疾病、肿瘤等)后的供体B 淋巴细胞的抗体基因构建。对于特定免疫抗原的抗体淘选的效率较高，但一般仅适用于一种特异性抗体的选择，库容量要求不高，一般106-108的库容量就可满足需要。

天然库：

不用免疫动物。抗体均来源于人类，是完全的人源化抗体，但亲和力通常较低。骨髓内和骨髓外所有抗体基因都包含在内，所构建的抗体库适用于所有抗原所对应的抗体的选择，库容量要求较高，最小需要达到109，因为目前估算的自然界的抗原种类在这个数量级上。

免疫库的优势：

与天然库相比，从免疫库中能筛选到高亲和力、高特异性的抗体。由于经过免疫选择压力，库中针对相应免疫原的特异性的丰度会大大高于其他非特异性抗体，其中部分特异性抗体经过了免疫系统的亲和力成熟过程，从库容量较小(105 )的文库中就能筛选到针对免疫原的功能性抗体及其基因。

噬菌体筛选

噬菌体抗体库的筛选是关键环节，包括两个主要步骤: 淘筛和鉴定。

噬菌体筛选方法主要有：

筛选一般流程：

包被抗原及对照--bio-panning（3~4轮）--多克隆ELISA判定特异富集--单克隆ELISA（普健可做高通量96*n）--阳性克隆validated ELISA--确认克隆测序--重组抗体表达

噬菌体展示生物淘选流程