抗体多样性的基础：浅谈单抗的糖基化

抗体多样性的基础：浅谈单抗的糖基化单抗结构复杂多变，其末端的改变、糖基化、脱酰氨基作用、异构化、氧化、分裂、聚合等，都会引起单抗表面电荷的改变，就便是电荷异质性。对单抗电荷异质性分析方法常有：毛细管等电聚焦凝胶电泳（cIEF）和阳离子交换色谱法（CEX）等，根据出峰时间可将其分为酸峰、碱峰和主峰。当采用CEX分析时，酸峰早于主峰洗脱出来，而碱峰晚于主峰洗脱出来。电荷异质性图2 单抗的N位糖基化（图表来源于参考文献Recent Advances in the Understanding of Biological Implications and Modulation Methodologies of Monoclonal Antibody N-Linked High Mannose Glycans）单抗中常见的糖基化为复合型，以岩藻糖（Fuc）为核心，再由N-乙酰氨基葡萄糖（N-GlcNAc）分出两条等长的分支，其分支上伴

作者: 知行

一致性评价是仿制药生产的重要准则，用以保证仿制药与原研药质量及疗效的一致。工艺开发阶段会将原研药的质量属性作为仿制药是否合格的标准，常见的质量属性有糖基化、电荷异质性、聚体、毒理、生物活性等，下面就单抗结构及糖基化、电荷异质性和聚体进行简单介绍。

单克隆抗体IgG1呈Y形结构，由抗原结合部位（Fab）和可结晶部位（Fc）构成，如图1。包含两条相同的重链（约55kDa）和两条相同的轻链（约25kDa），其中重链由VH、CH1、铰链区、CH2和CH3组成，轻链由VL和CL组成。

从抗体作用机制来讲，Fab段可以与特定的抗原结合，同时还可直接参与细胞死亡；Fc段可以与免疫细胞表面表达的Fc受体（FcγRI，FcγRII，FcγRIII）、血液中的补体（C1q）和FcRn结合，一方面激活抗体依赖的细胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）和补体依赖的细胞毒性作用（Complement-dependent cytotoxicity，CDC）对癌细胞进行杀伤，另一方面决定抗体的半衰期。另外，抗体的糖基化修饰也发生在Fc段，位于天冬酰胺Asn297位。

图2 单抗的N位糖基化

（图表来源于参考文献Recent Advances in the Understanding of Biological Implications and Modulation Methodologies of Monoclonal Antibody N-Linked High Mannose Glycans）

单抗中常见的糖基化为复合型，以岩藻糖（Fuc）为核心，再由N-乙酰氨基葡萄糖（N-GlcNAc）分出两条等长的分支，其分支上伴以甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）和唾液酸（Sia），根据其糖链上单糖修饰不同可对其进行分类。不同的糖基化修饰对抗体的安全性、生物活性、稳定性、半衰期等影响不同，如唾液酸化可增加抗体稳定性、岩藻糖化会降低抗体的半衰期、去岩藻糖化会显著加强抗体的ADCC活性等，已有研究表明半乳糖、尿苷和锰离子的可以对单抗的糖基化进行调节，此外培养温度及pH也是影响糖基化的重要影响。

电荷异质性

单抗结构复杂多变，其末端的改变、糖基化、脱酰氨基作用、异构化、氧化、分裂、聚合等，都会引起单抗表面电荷的改变，就便是电荷异质性。对单抗电荷异质性分析方法常有：毛细管等电聚焦凝胶电泳（cIEF）和阳离子交换色谱法（CEX）等，根据出峰时间可将其分为酸峰、碱峰和主峰。当采用CEX分析时，酸峰早于主峰洗脱出来，而碱峰晚于主峰洗脱出来。

表1中是对可引起酸峰或碱峰增加的修饰的总结，一般认为N位糖基化、C末端赖氨酸不均一性、氨基酸氧化、天冬酰胺脱酰胺化及天冬氨酸异构化、共价加合物和N末端谷氨酰胺及谷氨酸环化是较常见的导致电荷异质性的原因。

电荷异质性也是影响抗体活性的重要因素，其修饰区域决定是否对抗体产生影响。高水平的唾液酸化会影响单抗与Fc??RIIIa的结合，进而导致ADCC活性的降低；还没有明确的证据证明C末端赖氨酸不均一性、蛋氨酸氧化及N末端谷氨酰胺及谷氨酸环化对抗体会造成影响，此外天冬酰胺脱酰胺化单抗ADCC功能及半衰期的影响还有待确认。由于抗体结构细微改变都有可能会对抗体表面电荷产生影响，即使其对抗体作用的影响还不明确，保持仿制药与原研药的电荷异质性一致依然十分重要。

表1 产生酸峰和碱峰的修饰

（图表来源于Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies）

聚体

纯度不仅是保证单抗效用的基本条件之一，也是药物安全性的要求，杂质不单单包括其他蛋白（宿主蛋白等），有时聚体也是一种杂质。聚体的形成几乎是不可避免的，单抗在生产、储存、运输和注射到病人体内时都会伴随缓慢的聚体形成过程。聚体的存在不仅会降低药物的效果，最重要的是还会引起机体的免疫反应，存在潜在的安全问题。

聚体的产生是一个复杂的过程，简单来讲就是单体蛋白聚集形成由两个或多个蛋白组成的稳定复合物。抗体氨基酸序列的错误折叠、不完全折叠都有可能造成'hot spots'的暴露，其具有较强的形成聚体倾向（一般为氨基酸序列，具有高度疏水性、低电荷性且易形成β-折叠），并以'hot spots'为核心将不同单体聚集在一起，进而形成为同类型的聚体，如图3所示，其中红色区域表示'hot spots'。

图3 单抗形成聚体的路径示意图

（图片来源于Therapeutic Protein Aggregation: Mechanisms Design and Control）

通过基因手段可以阻碍聚体的形成，如突变暴露的氨基酸残基、在抗体末端增加带电多肽、促进CDRs边缘氨基酸突变等；对抗体生产、储存环境的改变也可增加聚体形成阻力，如pH、溶液离子强度、温度等。这些措施均可增加单抗的表面电荷，从而增强单体与单体间的静电排斥作用，用以抵消'hot spots'间的强疏水作用力，抑制聚体的形成。

来源：CPhI制药在线