质粒提取的三种方法：质粒提取鉴定及保存
质粒提取的三种方法：质粒提取鉴定及保存h） 加入600 µl溶液PW， 12000 rpm离心1分钟； 此步骤再重复1次； 弃废液后空管再次12000 rpm离心2分钟。g） 加入500 µl溶液PD， 12000 rpm离心1分钟。d） 加入250µl溶液P2， 快速上下颠倒8次， 常温静置3分钟， 可见混合液逐渐变清、 粘稠， 表示已充分裂解。e） 再加入350 µl溶液Ⅲ， 快速上下颠倒8次， 可见白色絮状物出现。f） 常温12000rpm离心10分钟， 所得上清液倒入已经用BL平衡过的过滤柱中，注意不要倒入白色絮状物沉淀， 静置3分钟， 12000 rpm离心1分钟。
（1） 质粒的提取 (Tiangen质粒提取试剂盒)：
a） 挑菌： 选取培养板中大小中等的单个菌落， 消毒牙签接种到10ml摇菌管中， 其中含有卡那霉素的LB约5ml， 37 °C， 220rpm恒温摇床中震荡培养过夜。
b） 取上述2.0ml培养液， 于常温下12000 rpm离心1分钟， 弃上清， 干燥沉淀。
c） 加入250µl溶液P1(配有去RNA酶， 4 °C保存)， 涡旋振荡， 完全悬浮细菌，不能留有沉淀， 否则会影响裂解。
d） 加入250µl溶液P2， 快速上下颠倒8次， 常温静置3分钟， 可见混合液逐渐变清、 粘稠， 表示已充分裂解。
e） 再加入350 µl溶液Ⅲ， 快速上下颠倒8次， 可见白色絮状物出现。
f） 常温12000rpm离心10分钟， 所得上清液倒入已经用BL平衡过的过滤柱中，注意不要倒入白色絮状物沉淀， 静置3分钟， 12000 rpm离心1分钟。
g） 加入500 µl溶液PD， 12000 rpm离心1分钟。
h） 加入600 µl溶液PW， 12000 rpm离心1分钟； 此步骤再重复1次； 弃废液后空管再次12000 rpm离心2分钟。
i） 于超净台通风干燥， 放置2-5分钟， 加入33µl已加热至65 °C的已灭菌的ddH 2 O， 室温静置3分钟， 12000 rpm离心2分钟， 得到相关质粒DNA， 测浓度， -20 °C保存备用。
（2） 质粒鉴定及保存
取100ng上述提取的质粒， 进行酶切（反应体系见前）， 随后用0.8%琼脂糖凝胶电泳以鉴定（方法同前所述）， 最后将粗略鉴定正确的样本送至生物技术公司测序。 如测序正确， 用50%灭菌甘油300µl 700µl的菌液， 标记于-80 °C保存备用。
11） 质粒或PCR产物纯化（胶回收）
（1） 琼脂糖电泳酶切或 PCR 相关产物。
（2） 在紫外投射反射仪割取含有目的片段的琼脂糖凝胶片段， 割取要迅速， 以避免紫外线对 DNA 的损伤， 但注意尽量割取目的片段， 减少无目的片段的凝胶量， 以便提高纯化回收效率。
（3） 用天平称先称区空 EP 管重量， 再称取含有凝胶的 EP 管重量， 计算得到凝胶重量（mg）， 加入等量体积（µl） Bindingbuffer（如 1 mg=1 μl）。
（4） 将含有凝胶的 EP 管置入 60 °C 恒温水浴箱中融化凝胶， 持续 8-10min，间或拿出摇匀， 以确保完全凝胶溶解。
（5） 将上述凝胶溶液转移至干净的纯化柱上， 室温下静置吸附 3 分钟。
（6） 将纯化柱 12000rpm 离心 1 分钟， 弃超滤液， 必要时可将超滤液重新离心1 次可提供纯化效率； 再次加入 100µl Binding buffer， 12000rpm 离心 1 分钟。
（7）加入 700µl Wash buffer （事先已经加入无水乙醇）， 12000 rpm 离心 1 分钟，弃超滤液； 空管 12000 rpm 离心 2 分钟。
（8） 纯化柱置于 1.5 毫升干净离心管中， 于超净台通风干燥 5 分钟。
（9） 加入 30µl 已加热至 65 °C 的已灭菌的 ddH 2 O， 室温静置 3 分钟， 12000 rpm离心 2 分钟， 得到相应的 DNA 片段， 测浓度， -20 °C 保存备用。
艾柏森提供质粒测序服务
艾柏森服务优势
艾柏森生物科技有限公司致力于基因、重组蛋白、抗体、噬菌体文库等生物制剂的研发，并致力于为客户提供一站式的CRO技术服务。
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