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佑安科技有限公司：佑安学术佑安创新本研究通过建立HBV cccDNA阳性肝组织样本，对qPCR、PCR-CRISPR、RCA-qPCR、RCA-PCR-CRISPR、ddPCR和RCA-ddPCR六种方法进行了灵敏度的比较。结果表明，RCA-PCR-CRISPR方法的灵敏度为1 copy/μL，与ddPCR和RCA-ddPCR方法的灵敏度相同，都优于其他检测方法。图3 HBV cccDNA qPCR PCR-CRISPR与ddPCR检测结果对比本研究利用CRISPR新技术，并联合RCA和PCR方法，建立了RCA-PCR-CRISPR检测HBV cccDNA的新方法，并进行了临床样本的验证。首先在样本中提取总DNA，PSAD消化样本中非环状DNA；其次设计HBV cccDNA特异性引物，利用RCA和PCR方法对其进行扩增和转录；最后筛选高特异性crRNA，并利用CRISPR/Cas13a技术检测HBV cccDNA。图2 H

近期，首都医科大学附属北京佑安医院任锋教授科研团队在国际期刊《Hepatology International》（2021IF=8.586）发表了题为“CRISPR/Cas13-assisted Hepatitis B Virus Covalently Closed Circular DNA Detection”的学术论文，该团队利用CRISPR/Cas13a检测新技术，联合滚换扩增（RCA）和聚合酶链反应（PCR）方法，建立了“CRISPR-based cccDNA assay”检测方法，为临床评价慢乙肝治疗终点提供了很好的监测手段。首都医科大学附属北京佑安医院副研究员张向颖、博士研究生田原和徐玲为共同第一作者，任锋教授、马迎民教授和中国军事医学科学院微生物与流行病学研究所李浩副研究员为共同通讯作者。

图1CRISPR/Cas13-assistedHepatitis B Virus Covalently Closed Circular DNA Detection

HBV感染是影响全世界人民健康的主要公共卫生问题，有超过2.5亿的HBV感染者。主要的抗病毒药物如核苷（酸）类似物（NAs）和α干扰素（INFα）等都不能完全治愈HBV，根本原因在于不能彻底清除的共价环状闭合DNA（cccDNA）。HBV cccDNA是病毒RNA复制转录的模板，它以微染色体的形式长期稳定的存在于肝细胞核中。因此，建立一种有效的HBV cccDNA检测方法，对于临床抗病毒治疗效果的评价和治疗策略的调整都具有重要意义。目前，检测HBV cccDNA的方法有Southern印迹杂交、巢式PCR、RCA和微滴数字PCR（ddPCR），但由于这些方法存在操作复杂、灵敏度低和成本较高等局限性没有被广泛使用。

规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas）是大多数细菌及古细菌中抵御病毒入侵的一种获得性免疫方式。CRISPR/Cas系统介导的免疫机理：当病毒首次入侵时，细菌会将病毒的小片段DNA整合到自身的CRISPR间隔区；病毒再次入侵时，CRISPR转录生成一条前体CRISPR RNA（pre-crRNA），pre-crRNA被RNA内切酶切割生成含有与病毒靶标序列匹配的成熟CRISPR RNA（crRNA），该crRNA引导具有核酸内切酶活性的Cas蛋白对靶标序列进行识别和降解。2016年6月，张锋等报道了Cas13a是一种在crRNA引导下与靶标RNA特定位点结合并切割的核酸内切酶，并将Cas13a与重组酶聚合酶等温扩增技术结合，开发了一个兼具高特异性和灵敏性的酶解锁报告探针（Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing，SHERLOCK）的核酸检测系统，实现了单个核酸分子的检测。2018年，杜德娜等发现当Cas12a特异性结合和切割目标双链DNA后，具有非特异性切割单链DNA（single strand DNA，ssDNA）的活性，并利用Cas12a的该附属切割活性开发了一个基于DNA内切酶靶向CRISPR非特异性的报告探针（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter，DETECTR）的核酸检测系统。研究进一步证明：基于CRISPR技术可实现快速、精确、便携式的核酸诊断，有望成为新一代核酸检测新技术。

本研究利用CRISPR新技术，并联合RCA和PCR方法，建立了RCA-PCR-CRISPR检测HBV cccDNA的新方法，并进行了临床样本的验证。首先在样本中提取总DNA，PSAD消化样本中非环状DNA；其次设计HBV cccDNA特异性引物，利用RCA和PCR方法对其进行扩增和转录；最后筛选高特异性crRNA，并利用CRISPR/Cas13a技术检测HBV cccDNA。

图2 HBV cccDNA-CRISPR检测方法流程图

本研究通过构建HBV cccDNA质粒，对比了ddPCR、qPCR和PCR-CRISPR三种方法的灵敏度。结果表明，PCR-CRISPR方法的灵敏度为1 copy/μL，优于其他两种方法。并把质粒转染到Huh7细胞中进行相同的检测，结果显示PCR-CRISPR方法的灵敏度同样高于其他两种方法。

图3 HBV cccDNA qPCR PCR-CRISPR与ddPCR检测结果对比

本研究通过建立HBV cccDNA阳性肝组织样本，对qPCR、PCR-CRISPR、RCA-qPCR、RCA-PCR-CRISPR、ddPCR和RCA-ddPCR六种方法进行了灵敏度的比较。结果表明，RCA-PCR-CRISPR方法的灵敏度为1 copy/μL，与ddPCR和RCA-ddPCR方法的灵敏度相同，都优于其他检测方法。

本研究利用qPCR、PCR-CRISPR、RCA-qPCR、RCA-PCR-CRISPR和ddPCR五种方法对40个HBV相关病人的肝组织和24个HBV相关病人的血浆、全血和外周血单核细胞（PBMC）进行了检测。结果表明，RCA-PCR-CRISPR方法对肝组织的检出率为72.5%，高于其他检测方法。

图4 HBV cccDNA 临床样本不同检测方法结果

综上所述，本研究建立了一种具有高灵敏性和高特异性检测HBV cccDNA的“CRISPR-based cccDNA assay”新方法，这种方法的广泛应用将为HBV抗病毒治疗的评价和停药后再复发监测提供重要的指导意义。