什么叫雄性不育株怎么杂交：育种家看过来 利用基因编辑快速创制雄性不育系

什么叫雄性不育株怎么杂交：育种家看过来 利用基因编辑快速创制雄性不育系图8Gmams1-1突变体植物表现出雄性不育(Chen et al. 2021)。（A）WT和Gmams1-1植物的表型对比；（B）WT和Gmams1-1植物成熟时的豆荚对比；（C）WT和Gmams1-1花粉粒的I2-KI染色；（D）WT和Gmams1-1花粉粒的亚历山大染色；（E）WT和Gmams1-1花粉粒的扫描电镜照片。图7 CRISPR/Cas9载体和GmAMS基因中靶位点的结构图(Chen et al. 2021)。大豆2021年6月2日，冯献忠团队在The Crop Journal上发表了题为“Generation of male-sterile soybean lines with the CRISPR/Cas9 system”的研究论文。该研究表明CRISPR/Cas9技术可在短时间内创制稳定的大豆细胞核雄性不育突变体，加速大豆雄性不育系的育种周期，为大豆杂交育种系统提

图4 利用基因编辑创制玉米不育系和保持系的载体构建示意图及工作流程(Qi et al. 2020)。（A）MS26ΔE5-Editor载体构建示意图；（B）MGM载体构建示意图；（C）将MS26ΔE5-Editor载体与MGM载体共转植物细胞；（D）在杂交种子生产中生成雄性不育系（GMS）和保持系（MGM）的工作流程，♂：雄性配子体、♀：雌性配子体、1n：单倍体细胞、2n：二倍体细胞。

作者首先设计了一个MS26ΔE5编辑器（图4A），来对玉米的内源育性基因ZmMS26进行编辑从而创制雄性不育系。在sgRNA的引导下Cas9蛋白通过剪掉ZmMS26的一小段，使该基因失去功能，从而导致玉米雄性不育。在杂交体系中，使用不育系作为母本，就可以与其他父本优势种杂交获得杂交种。

另外，作者还构建了另一个载体MGM用于创制保持系（图4B），该载体包含三个功能模块：一个是用于恢复植株雄性不育的育性的MS26 CDS表达元件、另一个是能导致花粉失去活性的酶、最后一个是会让玉米粒发出红色荧光的标记基因。通过将MGM载体与MS26ΔE5编辑载体共同转化到宿主细胞中后，由于MGM拷贝中的MS26 CDS缺少sgRNA的靶位点，因此并不会被剪切（图4C）。此外，MGM上携带的花粉淀粉酶基因会造成花粉败育，因此只有不携带MGM的花粉可以作为雄配子，雌配子则一半携带MGM，一半不携带MGM（图4D）。当使用保持系自交时，最终会获得一半不育系和一半保持系。而在后期不育系和保持系的筛选中，由于MGM上含有荧光基因，因此保持系的玉米籽粒会发出红色荧光，这极大的简化了后期的筛选流程（图5）。值得注意的是，在这个系统中，不育系植株不携带外源性的MGM基因，因此只要是与非转基因品种杂交产生的后代，就不是转基因作物。

图5 红色荧光标记可作为筛选保持系的标记(Qi et al. 2020)。（A）在明场（左）和554nm波长激发光下用滤光片（右）拍摄的玉米籽粒表型；（B）在体式显微镜（Nikon SMZ1500 Japan）下，携带DsRED的保持系种子纵向剖面的彩色图像；（C）共聚焦显微镜图像显示保持系种子中单层胚乳糊粉中DsRED（红色）的特异性表达；（D-E）使用植物成像系统来区分不同种子中的荧光强度；（F）保持系自交后代分离比的卡方检验结果。

大豆

2021年6月2日，冯献忠团队在The Crop Journal上发表了题为“Generation of male-sterile soybean lines with the CRISPR/Cas9 system”的研究论文。该研究表明CRISPR/Cas9技术可在短时间内创制稳定的大豆细胞核雄性不育突变体，加速大豆雄性不育系的育种周期，为大豆杂交育种系统提供新的不育系材料。绒毡层细胞，即最接近花粉的体细胞层，它可以调节孢子发生和花粉壁发育。ABORTED MICROSPORES（AMS）基因是一种影响拟南芥绒毡层发育的bHLH转录因子。作者利用拟南芥AMS的蛋白序列，鉴定了AMS基因的两个大豆直系同源物Glyma.10G281800和Glyma.20G107500（图6），并分别命名为GmAMS1和GmAMS2，通过CRISPR/Cas9技术对大豆中的这两个AMS同源物进行了靶向编辑来创制稳定的大豆细胞核雄性不育系（图7）。结果显示CRISPR/Cas9技术对GmAMS1的靶向编辑导致大豆产生了雄性不育的表型，与野生型花粉相比，Gmams1-1突变植物的花粉粒呈现出皱缩的形态（图8），而GmAMS2的靶向编辑未能获得雄性不育系。GmAMS1不仅影响花粉壁的形成，还影响小孢子和绒毡层细胞的发育，它可以通过调节细胞程序性死亡（Programmed cell death，PCD）来控制大豆绒毡层的发育和降解（图9）。

图6 GmAMS的系统发育树及其保守基序分析(Chen et al. 2021)。（A）GmAMS的系统发育树；（B）GmAMS的保守基序及其同源物，由彩色框表示。

图7 CRISPR/Cas9载体和GmAMS基因中靶位点的结构图(Chen et al. 2021)。

图8Gmams1-1突变体植物表现出雄性不育(Chen et al. 2021)。（A）WT和Gmams1-1植物的表型对比；（B）WT和Gmams1-1植物成熟时的豆荚对比；（C）WT和Gmams1-1花粉粒的I2-KI染色；（D）WT和Gmams1-1花粉粒的亚历山大染色；（E）WT和Gmams1-1花粉粒的扫描电镜照片。