什么叫雄性不育株怎么杂交：育种家看过来 利用基因编辑快速创制雄性不育系

什么叫雄性不育株怎么杂交：育种家看过来 利用基因编辑快速创制雄性不育系作者首先在模式植物蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中通过反向遗传学策略筛选雄性不育靶标基因。前期研究报道称，禾本科中的雄性不育是由编码葡萄糖-甲醇-胆碱（Glucose-Methanol-Choline GMC）氧化还原酶基因的单基因纯合突变造成的，但是在双子叶植物中尚无相关报道。因此，作者通过对苜蓿、拟南芥、水稻、玉米中的GMC氧化还原酶家族基因进行系统发育分析，发现蒺藜苜蓿Medtr5g011020与已报道的雄性不育基因遗传距离较近，结合该基因在花蕾发育早期雄蕊中特异性高表达，因此推断Medtr5g011020可能参与苜蓿雄性育性调控，并将其命名为MtNP1。接下来，作者利用优化过的苜蓿基因编辑工具靶向野生型中的MtNP1来构建突变材料，筛选到的纯合移码突变体Mtnp1没有观察到任何营养生长缺陷，在生殖阶段表现为只开花未结果的雄性不育表型（图13），因此可以确定Mt

图9 来自WT和Gmams突变体的四个发育阶段的花药裂片的切片，用甲苯胺蓝染色后的结果(Chen et al. 2021)。绒毡层（T）、小孢子母细胞（Msp）、隔膜（St）和花粉粒（PG）由箭头指示。

番茄

2020年1月10日，李传友团队和李常保团队合作在The Plant Journal上发表了题为“A biotechnology-based male sterility system for hybrid seed production in tomato”的研究论文。该研究提出了一种利用基因编辑技术在番茄骨干自交系背景中快速创制雄性不育系和保持系，并有效应用于杂交种子生产的策略。首先为了创制雄性不育系，作者在番茄的基因组中鉴定到了154个在雄蕊中特异性表达的基因，结合数据分析最终选取其中的一个基因SlSTR1作为靶标基因（图10）。在此基础上，作者设计了Cas9/sgRNA载体用于靶向SlSTR1的第一个外显子，通过将Cas9/sgRNA载体转化至番茄骨干自交系TB0993中对SlSTR1进行定向敲除，最终筛选出来了TB0993背景的雄性不育系（图11）。紧接着，作者将正常功能的SlSTR1基因和控制花青素合成的SlANT1基因连锁在一起，共同转回到前期筛选到的雄性不育系中，最终得到了育性恢复的紫色保持系。最后，将雄性不育系作为母本，保持系作为父本进行杂交，其子代会分离出一半非转基因的雄性不育系和一半转基因的保持系，通过幼苗的颜色可以非常方便的区分出雄性不育系（非紫色）来用于杂交育种（图12）。

图10 鉴定在番茄雄蕊中特异性表达的基因(Du et al. 2020)。（a）鉴定在雄蕊中特异性表达基因的方法；（b）划分成五个簇的2044个基因的表达模式；（c）来自簇3的154个基因在不同组织中的表达热图；（d）SlSTR1在不同组织中的表达情况；（e）示意图说明了sgRNA靶向SlSTR1编码序列的位点（红线）；（f）从三个CR-slstr1（T0代）株系中鉴定到的代表性突变。

图11 CR-slstr1-3-6植株在花粉发育和雄性生育力方面存在缺陷(Du et al. 2020)。（a-c）野生型（WT）和CR-slstr1-3-6花的形态比较；（d）WT和CR-slstr1-3-6花粉粒的扫描电镜照片；（e）WT和CR-slstr1-3-6花粉粒的直径；（f）WT和CR-slstr1-3-6花粉粒在开裂阶段的活力；（g）田间种植的CR-slstr1-3-6植株的结实缺陷表型照片；（h）CR-slstr1-3-6植物在自花授粉后不结果（红色箭头）；（i）CR-slstr1-3-6植物经WT花粉异花授粉后产生带种子的果实。

图12 新型番茄雄性不育系统的创制流程(Du et al. 2020)。（a）在幼苗阶段区分雄性不育植物（绿色子叶）和保持系植物（紫色子叶）的代表性照片。（b）基于基因编辑技术的杂交种子生产示意图。

苜蓿

2021年12月28日，王涛、董江丽团队在Plant Biotechnology Journal上发表了题为“Construction of genic male sterility system by CRISPR/Cas9 editing from model legume to alfalfa”的研究论文。该研究建立了利用高效基因编辑工具创制苜蓿隐性核不育系及其保持材料的方法，极大地促进了全球苜蓿产业的杂交优势利用。

作者首先在模式植物蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中通过反向遗传学策略筛选雄性不育靶标基因。前期研究报道称，禾本科中的雄性不育是由编码葡萄糖-甲醇-胆碱（Glucose-Methanol-Choline GMC）氧化还原酶基因的单基因纯合突变造成的，但是在双子叶植物中尚无相关报道。因此，作者通过对苜蓿、拟南芥、水稻、玉米中的GMC氧化还原酶家族基因进行系统发育分析，发现蒺藜苜蓿Medtr5g011020与已报道的雄性不育基因遗传距离较近，结合该基因在花蕾发育早期雄蕊中特异性高表达，因此推断Medtr5g011020可能参与苜蓿雄性育性调控，并将其命名为MtNP1。接下来，作者利用优化过的苜蓿基因编辑工具靶向野生型中的MtNP1来构建突变材料，筛选到的纯合移码突变体Mtnp1没有观察到任何营养生长缺陷，在生殖阶段表现为只开花未结果的雄性不育表型（图13），因此可以确定MtNP1能作为创制苜蓿雄性不育系的靶标。最后，作者在紫花苜蓿( Medicago sativa L. )栽培种（中国地方品种“保定苜蓿”）中利用优化过的苜蓿基因编辑工具靶向MsNP1来获得突变体材料。结合表型分析发现，全部等位移码突变的Msnp1突变体为雄性不育系材料（图14）。而三等位杂合突变体能够产生成熟花粉粒，可作为保持材料与全等位突变体进行姊妹交，后代能够稳定产生不育系基因型，并筛除外源转基因片段（图15）。

此外，通过重测序发现MsNP1靶点基因组区段在苜蓿全球核心种质中高度保守，因此，只要建立可行的转化体系，该研究设计的雄性不育基因编辑方案适用于不同遗传背景的紫花苜蓿材料。

图13 蒺藜苜蓿Mtnp1突变体的雄性不育表型(Ye et al. 2021)。（A）对Mtnp1突变体的全株（A1）、花（A2）、雄蕊和雌蕊（A3）、亚历山大染色（A4）、I2-KI染色（A5）进行分析；（B）Mtnp1突变体和野生型之间的人工杂交结果。