细胞基因验证（细胞意义非凡不修改DNA序列的表观遗传CRISPR来了）
细胞基因验证（细胞意义非凡不修改DNA序列的表观遗传CRISPR来了）研究者们利用sgRNA能够把Cas9引导到目标位点的能力，但避开了Cas9对的DNA剪切能力，而是将失去酶活性的Cas9（dCas9）与DNA甲基转移酶Dnmt3A、3L以及锌指蛋白10的KRAB结构域相融合，从而达到目标位点DNA甲基化的效果，实现目标基因表达的降低。同时，研究者还开发了匹配的CRISPRon，能够对CRISPRoff的编辑进行逆转。4月9日，一篇发表在《细胞》上的文章，报告了一项全新的基于CRISPR的表观遗传编辑技术[2]：CRISPRoff。当然可以了。既然基因先需要转录成为信使RNA，再被翻译生成蛋白质，那么在不影响编码基因的双链DNA的情况下，通过人为控制基因的转录，同样可以达到调控蛋白质表达的效果。这种新兴的技术，叫做表观遗传编辑，即不直接修改基因序列，而是通过DNA甲基化、组蛋白甲基化和乙酰化等方式，从转录层面调控目标基因表达。
CRISPR/Cas9基因编辑技术大家都不陌生了：利用一段单链RNA片段（常见的为single guide RNA，简称sgRNA）将核酸内切酶Cas9引导到目标位点，切断DNA双链，在此基础上即可实现对基因的剪切和编辑。
尽管风头正盛，CRISPR/Cas9的局限性好像也不绝于耳，比如脱靶效应、计划外的DNA片段丢失，以及激活的DNA修复机制可能引起细胞复杂的应激反应等等[1]。
既然基因编辑的目标是调控蛋白质的表达，那么，有没有可能绕过基因，从其他角度实现这个目标呢？
图源 | pixabay
当然可以了。
既然基因先需要转录成为信使RNA，再被翻译生成蛋白质，那么在不影响编码基因的双链DNA的情况下，通过人为控制基因的转录，同样可以达到调控蛋白质表达的效果。
这种新兴的技术，叫做表观遗传编辑，即不直接修改基因序列，而是通过DNA甲基化、组蛋白甲基化和乙酰化等方式，从转录层面调控目标基因表达。
4月9日，一篇发表在《细胞》上的文章，报告了一项全新的基于CRISPR的表观遗传编辑技术[2]：CRISPRoff。
研究者们利用sgRNA能够把Cas9引导到目标位点的能力，但避开了Cas9对的DNA剪切能力，而是将失去酶活性的Cas9（dCas9）与DNA甲基转移酶Dnmt3A、3L以及锌指蛋白10的KRAB结构域相融合，从而达到目标位点DNA甲基化的效果，实现目标基因表达的降低。同时，研究者还开发了匹配的CRISPRon，能够对CRISPRoff的编辑进行逆转。
这项技术从表观遗传层面实现基因表达的抑制，其效果不仅精准高效、适用基因广泛，更是经得住多达450代的细胞分裂、以及干细胞的分化，可以说是表观基因编辑技术的大进步！
CRISPRoff并不是世上第一个特异性表观遗传编辑技术。从原理上来讲，特异性的表观遗传编辑技术，都需要借助某些蛋白的DNA结合域（如锌指蛋白，转录激活因子样效应物核酸酶（TALE），以及Cas9等），将它们与能够改写表观基因标记的酶结合在一起，产生目标位点的表观基因改写[3]。这些技术的有效性，则既取决于DNA结合域的特异性，也取决于所结合的酶的功效。
然而，目前的表观遗传编辑技术编辑效果还很有限，想要得到稳定的效果，需要在细胞内长期表达相关的功能性蛋白，如果需要针对多个基因，还需要引入多个功能性蛋白。这不仅使得该技术在实验室里用起来不便，更大大限制了它作为新型基因治疗手段的转化前景。
相比之下，CRISPRoff的表现非常优秀。
具体有多优秀呢？研究者们在对HEK293T细胞系转染了一次表达融合蛋白的质粒和sgRNA后，检测到目标基因编码的蛋白表达明显下降，相应地，目标基因转录的信使RNA减少，其CpG岛的DNA甲基化增加。
重点来了：50天后，细胞已经经过多代分裂，dCas9融合蛋白早在40天前就检测不到了，依然有超过90%的细胞保持了基因表达关闭的状态。这说明，仅仅一次dCas9融合蛋白的表达和sgRNA递送，就可以得到持久的表观基因编辑效果！
经过CRISPRoff处理后的细胞，50天后保持了基因表达沉默的状态（左），目标基因CGI甲基化显著增加（右，黑点代表检测到DNA甲基化）
CRISPRoff还具有优异的特异性以及适用广泛性。
全基因组亚硫酸盐测序结果显示，在目标基因前后55kb的范围内，只有目标基因的CpG岛DNA甲基化水平出现显著增加，说明了CRISPRoff并不会影响到目标位点邻近序列的表观基因状态。
只有目标基因CLTA的CpG岛甲基化显著增加（蓝色为未甲基化）
为了探索CRISPRoff的适用广泛性，研究者们使用了一个针对超过20000个基因的sgRNA库，进行了一个drop-out screen。
简而言之，因为这些目标基因中有很多对细胞存活至关重要（essential genes），它们一旦被CRISPRoff沉默，就会导致细胞的死亡，相应的sgRNA也会随之消失。通过检测存活下来的细胞中的sgRNA，就可以知道哪些基因被有效地沉默了。
深度测序结果显示，在CRISPRoff处理过的细胞中，绝大多数影响细胞存活的基因都被有效沉默了，说明了CRISPRoff的广泛实用性。
在经CRISPRoff处理后存活下来的细胞中，检测到与essential genes有关的sgRNA广泛减少
这些都还不够， CRISPRoff的优秀之处还体现在，它的表观遗传改写效果，居然在细胞分化后也可以保持。
在干细胞分化的过程中，表观遗传需要经过大量变化，以大范围调控许多基因的表达状态。研究者们发现，在诱导性多能干细胞中引入CRISPRoff，并诱导其分化为神经元细胞，分化后的细胞仍然保留了目标基因的表达水平降低效果。
经过CRISPRoff处理的iPSC，经诱导分化为神经元细胞后，其基因沉默效果依然保持，与未经诱导的iPSC沉默水平相近
这么稳定且持久的表观基因改写效果，想反悔怎么办？没关系，该研究团队还针对性地开发了“后悔药”——CRISPRon技术，用于逆转CRISPRoff的编辑效果。
CRISPRon的原理与CRISPRoff类似，同样是利用了sgRNA和dCas9组合的定位能力，只是在dCas9上融合了DNA去甲基酶。在细胞系中的测试结果显示，CRISPRoff处理过的细胞，经过一次CRISPRon的处理后，有74%恢复了目标基因的表达，目标基因的CpG岛甲基化也基本消失。
CRISPRon可以逆转CRISPRoff的表观基因编辑效果，包括基因表达的恢复（左）和DNA甲基化的恢复（右）
有趣的是，CRISPRoff的开发过程中还有“意外之喜”。
众所周知，DNA由A、T、C、G四种碱基编码而成，通常来说，只有与G相邻的C可以被甲基化。在人类基因组中，只有70%的基因具有CpG岛，也就是说，按照已知的表观基因调控机制来说，有30%的基因是无法被通过DNA甲基化来调控的。
但是，在对CRISPRoff的表征中，研究者们发现，一部分可以被CRISPRRoff改写的基因，并没有传统意义上CpG岛，说明现有的表观遗传学理解还远不是全部。鉴于科学界对表观遗传的“求知若渴”，以及表观遗传在一些疾病中的重要作用，CRISPRRoff作为一项潜在的表观基因研究工具，也是意义非凡。
总的来说，CRISPRoff使用灵活，效果稳定、可逆，适用基因广泛，且编辑效果耐细胞分裂与分化，可以说令人耳目一新！无论是在基础研究中，用来研究细胞自有的表观遗传调控机制、或者通过调控表达来研究一些重要基因在细胞分化过程中的作用，还是在细胞治疗和基因治疗中的转化前景，CRISPRoff都算得上是未来可期。
参考文献：
1.Yeh CD Richardson CD Corn JE. Advances in genome editing through control of DNA repair pathways. Nat Cell Biol. 2019 Dec;21(12):1468-1478. doi: 10.1038/s41556-019-0425-z. Epub 2019 Dec 2. PMID: 31792376.
2.Nuñez JK Chen J Pommier GC Cogan JZ Replogle JM Adriaens C Ramadoss GN Shi Q Hung KL Samelson AJ Pogson AN Kim JYS Chung A Leonetti MD Chang HY Kampmann M Bernstein BE Hovestadt V Gilbert LA Weissman JS. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 2021 Apr 29;184(9):2503-2519.e17. doi: 10.1016/j.cell.2021.03.025. Epub 2021 Apr 9. PMID: 33838111.
3.Xu X Qi LS. A CRISPR-dCas Toolbox for Genetic Engineering and Synthetic Biology. J Mol Biol. 2019 Jan 4;431(1):34-47. doi: 10.1016/j.jmb.2018.06.037. Epub 2018 Jun 26. PMID: 29958882
4.Holtzman L Gersbach CA. Editing the Epigenome: Reshaping the Genomic Landscape. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2018 Aug 31;19:43-71. doi: 10.1146/annurev-genom-083117-021632. Epub 2018 May 31. PMID: 29852072.
5.University of California - San Francisco. "New CRISPR technology offers unrivaled control of epigenetic inheritance." ScienceDaily. ScienceDaily 16 April 2021. <www.sciencedaily.com/releases/2021/04/210416131923.htm>.
本文作者 | 刘 一
责任编辑 | 代丝雨
