环状rna的化学修饰（环状RNA表达载体新策略）

环状rna的化学修饰（环状RNA表达载体新策略）RtcB介导tricRNAs环化拼接（来自(Lu et al. 2015)）古生物和真核生物负责tRNA基因内含子切除后拼接的是RtcB系列的酶，作者通过RNAi证实RtcB酶不仅负责了tRNA序列的拼接，也负责了tricRNAs的环化过程。这个过程并不依赖反向互补的RNA序列，但tRNA基因的内含子两侧的序列是高度保守的，可能与RtcB酶的识别和拼接作用有关，这段内含子重要的结构特征是存在bulge-helix-bulge（BHB）motif。A. Gregory Matera教授团队开发了一个新的专门分析常规分析RNA-Seq数据中无法正确mapping至基因组序列的Reads的工具软件：Vicinal。作者分析果蝇的转录组数据中，发现了定位于tRNA基因CR31905的环状RNA。进一步，作者通过比较不同物种中该tRNA基因的内含子长度，以及不同果蝇品系中该区域内含子序列的同源性比

在新近的酶学方法中，A. Gregory Matera教授发表了一种基于tRNA改造的环状RNA表达载体技术(Schmidt et al. 2016)。下面就让我们一起深入了解一下这个载体系统吧。

设计思路的来源：

本文的通讯作者，A. Gregory Matera教授之前就曾在后生动物中发现了有些tRNA分子中存在内含子序列，且这些内含子序列也会形成环状RNA分子，称为tricRNAs(Lu et al. 2015)。（PS：后生动物指在胚胎发育过程中有胚层分化的动物。）tRNA的转录由RNA聚合酶III介导，与mRNA的通过RNA聚合酶II介导的转录过程不同，RNA聚合酶III的起始转录调控元件位于起始转录位点的下游。tRNA的转录后加工过程也很有特点，需要首先切除5’和3’末端的冗余序列，然后在3’端增加CCA，然后会经过一系列的碱基修饰作用，最终变成成熟的tRNA分子。在很多的tRNA基因中存在内含子，三界的生物中均存在。原核生物中tRNA基因的内含子是一种核酶，能自动切除，而古生物和真核生物中tRNA的内含子需要通过TSEN核酸酶切除。在这篇文章中A. Gregory Matera教授发现了tRNA的内含子能够形成环状RNA（tricRNAs），尤其是在后生动物中还是非常保守的。作者因此首先提出并设计了一套基于tRNA的环状RNA表达载体。

tricRNAs怎么发现的？

A. Gregory Matera教授团队开发了一个新的专门分析常规分析RNA-Seq数据中无法正确mapping至基因组序列的Reads的工具软件：Vicinal。作者分析果蝇的转录组数据中，发现了定位于tRNA基因CR31905的环状RNA。进一步，作者通过比较不同物种中该tRNA基因的内含子长度，以及不同果蝇品系中该区域内含子序列的同源性比较，获得了该内含子区域相对保守的二级结构和序列。通过RT-PCR，Northern实验验证了环状RNA的存在。

利用Vicinal工具发现了tRNA基因的内含子环状RNA（来自(Lu et al. 2015)）

tricRNAs如何形成的？

古生物和真核生物负责tRNA基因内含子切除后拼接的是RtcB系列的酶，作者通过RNAi证实RtcB酶不仅负责了tRNA序列的拼接，也负责了tricRNAs的环化过程。这个过程并不依赖反向互补的RNA序列，但tRNA基因的内含子两侧的序列是高度保守的，可能与RtcB酶的识别和拼接作用有关，这段内含子重要的结构特征是存在bulge-helix-bulge（BHB）motif。

RtcB介导tricRNAs环化拼接（来自(Lu et al. 2015)）

载体怎么设计的？

作者首先将tRNA基因克隆下来，在tRNA基因基因的上游增加一段聚合酶III的启动子（5S、7SK、U6），作者的经验表明在完整启动子的序列基础上多增加一小段核酸序列能提高启动子效率。在tRNA基因内含子的BHB区域设计酶切位点（文中用到了NotI和SacII）可在这两个酶切位点中间设计插入需要表达的环状RNA序列。

利用tRNA拼接体系设计环状RNA表达载体（来自(Schmidt et al. 2016)）

利用tRNA拼接体系设计环状RNA表达载体设计（来自(Schmidt et al. 2016)）

活细胞示踪环状RNA的技术：

在这篇酶学方法的文章中，作者用到了一种已报道的RNA染料进行活细胞示踪。DFHBI-1T已报道可以特异性结合Broccoli或Spinach2元件，只有结合之后才能发出荧光。且该染料对细胞的毒性作用较小，非常适合作为活细胞示踪的用途。

利用DFHBI-1T染料和Broccoli元件实现活细胞环状RNA示踪表达后（来自(Schmidt et al. 2016)）

总结与展望：

在本文中，A. Gregory Matera教授为我们展示了一种新型的环状RNA表达载体。与经典的基于反向互补元件诱导环化拼接的环状RNA表达载体有很大区别。山人以为，两者各有优势：

1. 传统的环状RNA表达载体基于反向互补的RNA序列（如Alu元件），基于内源性RNA拼接和环化相关的酶系实现环状RNA的表达，可以实现精确的序列表达，但表达效率不是非常稳定。

2. 利用tricRNAs环化拼接体系过表达环状RNA载体利用了RNA聚合酶III的转录体系，表达效率优于RNA聚合酶II（mRNA的转录酶），因此理论上这种表达载体的过表达效率更高。但从全文的介绍来看，这个载体还不能自动去除BHB序列，因此最终的表达产物会额外带着BHB序列，有可能会影响环状RNA的功能。

总之，两种策略各有长短，具体到实际实验过程中需要综合分析验证才能得出更严谨的结论。此外文中介绍到的适合活细胞标记RNA的体系也是很有用的技术方法，希望能对诸位的研究工作有所帮助。

参考文献：

Lu Z.P. Filonov G.S. Noto J.J. Schmidt C.A. Hatkevich T.L. Wen Y. Jaffrey S.R. and Matera A.G. (2015). me tazoan tRNA introns generate stable circular RNAs in vivo. Rna 21 1554-1565.

Schmidt C.A. Noto J.J. Filonov G.S. and Matera A.G. (2016). A Method for Expressing and Imaging Abundant Stable Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing. Methods Enzymol 572 215-236.

文 | circRNA

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