southern杂交的原理和方法（Northern杂交）

southern杂交的原理和方法（Northern杂交）（1）0.1％DEPC-H2O：在1000mL的去离子水中加入1mL的DEPC于37℃下搅动处理过夜，在121℃高压灭菌处理20min。2．实验试剂【实验原理】Northern杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的RNA分子，从而判断在转录水平上基因是否表达及表达量，因此实验过程与Southern杂交很相似。Northern杂交的电泳是在变性条件下进行，以去除RNA分子中的二级结构，保证RNA完全按分子大小分离。变性电泳主要有3种：乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。本实验主要采用了甲醛变性电泳，电泳后转膜采用与Southern杂交相同的方法将RNA转移到尼龙膜上，然后与探针杂交。【实验材料、试剂及仪器】1．实验材料总RNA溶液。

【实验目的】

（1）掌握Northern杂交的原理。

（2）掌握采用Northern杂交来检测目的基因表达量差异的方法及操作步骤。

（3）熟练掌握RNA变性电泳的操作过程。

【实验原理】Northern杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的RNA分子，从而判断在转录水平上基因是否表达及表达量，因此实验过程与Southern杂交很相似。Northern杂交的电泳是在变性条件下进行，以去除RNA分子中的二级结构，保证RNA完全按分子大小分离。变性电泳主要有3种：乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。本实验主要采用了甲醛变性电泳，电泳后转膜采用与Southern杂交相同的方法将RNA转移到尼龙膜上，然后与探针杂交。

【实验材料、试剂及仪器】

1．实验材料总RNA溶液。

2．实验试剂

（1）0.1％DEPC-H2O：在1000mL的去离子水中加入1mL的DEPC于37℃下搅动处理过夜，在121℃高压灭菌处理20min。

（2）10×MOPS电泳缓冲液：取41.8g的MOPS于700mL的0.1％DEPC-H2O中，调整pH值到7.0，加20mL的1mol/L的乙酸钠和20mL的0.5mol/L EDTA（pH8.0），用0.1％DEPC-H2O调整到1L，过滤灭菌处理。

（3）10×甲酰胺加样缓冲液：0.5mol/L EDTA（pH8.0），10mg溴酚蓝，10mg二甲苯，10mL的去离子甲酰胺。

（4）其余试剂与Southern杂交实验相同，但是所配置的溶液均需经过DEPC处理。

（5）β-actin肌动蛋白基因的地高辛标记探针：序列是5’－AUGCCAUCCUGCGUCUG－3’。

（6）C-myc癌基因的地高辛标记探针：序列是5’－GGGCUUUAUCUAACUCGCUGUA－3’。

3．实验仪器

杂交炉（全班1台）

电泳仪（每8人1台）

振荡器（每8人1台）

离心机（每8人1台）

恒温烤箱（全班1台）

相机或凝胶成像分析系统（全班1台）

瓷盘（每8人1台）

尼龙膜（每4人1张）保鲜膜（每8人1卷）

3MM Whatman滤纸（每4人1张）

吸水纸（若干）

普通滤纸（若干）

【实验步骤】

1．制备RNA变性凝胶

（1）制备50mL含有2.2mol/L甲醛的1％的琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖加入到36mL DEPC-H2O中，取5mL的10×MOPS电泳缓冲液和9mL去离子甲醛混合制胶。

（2）RNA样品的预处理：电泳前先将20μg的RNA与2μL的10×MOPS电泳缓冲液、4μL甲醛和10μL的甲酰胺混匀，65℃孵育30min，冰浴冷却10min，然后加入2μL的甲酰胺加样缓冲液。

（3）在电泳槽中加入1×MOPS电泳缓冲液，50V预电泳5min，在凝胶加样孔中加入RNA样品，再在50V下电泳直至溴酚蓝移动到凝胶的前沿处，关闭电源。

2．凝胶转移

（1）电泳结束后，将凝胶转移到一瓷盘中，用0.1％DEPC-H2O漂洗几次，用刀片修去凝胶边缘无用的部分（包括加样孔上方的凝胶），在凝胶的左下角切去一小角做记号。

（2）在瓷盘中加入10倍体积于凝胶的变性溶液，室温下放置45min，并且轻轻摇动。

（3）用0.1％DEPC-H2O短暂浸泡凝胶，然后将凝胶浸于10倍体积于凝胶体积的中和缓冲液中，室温下放置30min，并且轻轻摇动；换1次中和缓冲液继续浸泡15min。

（4）在浸泡的过程中，先准备好转移用膜，用干净的刀片切割下一张每边较凝胶大1mm的尼龙膜，再切2张与膜同样大小的Whatman滤纸。

（5）先用刀片切去待转移的膜一角，然后将膜浸入到0.1％DEPC-H2O中，完全浸透5min以上。

（6）将1张Whatman滤纸放在1块玻璃板上，滤纸的两端要从玻璃板上垂下，放入到盛有转移缓冲液（10×SSC）的容器中（见图9.1），待转移缓冲液将滤纸完全浸湿后，用玻棒赶走气泡。

（7）将步骤（3）中的凝胶取出并倒转，使原来的底面向上，放置在滤纸中间，用保鲜膜包裹凝胶的四周，防止液体自液池直接流至凝胶上方的吸水纸。

（8）用适量转移缓冲液将凝胶湿润，将湿润的膜覆盖在凝胶上，切角对齐，赶走气泡，再将湿润的Whatman滤纸放置在膜上，同样赶走气泡。

（9）切1叠略小于Whatman滤纸的吸水纸（厚约5～8cm），将吸水纸放置在Whatman滤纸上，在吸水纸上方放1块玻璃板，然后压一重物，吸水8～24h，在转移的过程中要视情况及时的更换吸水纸。

（10）转移结束后，用铅笔做标记，转移到6×SSC漂洗5min，再将膜移至普通滤纸上，将多余的液体沥干后，将膜的RNA面向上放置于干的普通滤纸上数分钟，然后用254nm的紫外光照射1.75min。

3．杂交

（1）将膜放到6×SSC中，浸润2min，然后装入到杂交管内，加预杂交液，放到杂交炉中，68℃封闭6h。

（2）探针预先在沸水中热变性5min，迅速置冰浴中冷却，然后用预杂交液稀释探针（5～25ng/mL）加入到杂交管中，68℃杂交过夜。

（3）将膜从杂交管中取出，放入含有数百毫升2×SSC及0.5％SDS的平皿中，室温下将平皿放在缓慢旋转的平台上轻轻振荡5min。将此步骤重复1次。

（4）将膜放入含有数百毫升2×SSC及0.5％SDS的平皿中，42℃下将平皿放在缓慢旋转的平台上轻轻振荡15min。将此步骤重复1次。

（5）将浸泡的溶液换成0.1×SSC及0.1％SDS，65℃放置0.5～4h，并轻轻振荡，再在室温下用0.1×SSC洗膜。

4．检测参照实验19“实验步骤”4。

【实验注意事项】

（1）含甲醛的凝胶在RNA转移前需用经DEPC处理水淋洗数次，以除去甲醛。

（2）同实验19“实验注意事项”（1）～（9）。

【典型实验结果分析】理想实验结果（见图9.3）用不同浓度的抗肿瘤药物处理肿瘤细胞，C-myc癌基因的表达量随着抗肿瘤药物浓度的增加而减少，而作为参照物的β-actin基因的表达量无明显变化。

图9.3　Northern杂交结果1～4：抗肿瘤药物处理后的基因表达产物，1→4泳道的抗肿瘤药物的浓度依次增加

【实验讨论】问题：琼脂糖浓度较高或待分析的RNA相对分子质量较大时，该如何处理？

答：需用0.05mol/L NaOH浸泡凝胶20min，部分水解RNA并提高转移效率。浸泡后用0.1％DEPC-H2O淋洗凝胶，并用20×SSC浸泡凝胶45min，然后再转移到滤膜上。