体外诊断试剂检验技术手册（体外诊断原料纯化生产平台全攻略）

体外诊断试剂检验技术手册（体外诊断原料纯化生产平台全攻略）● 超高载量，6 分钟保留时间载量可达 80 mg/mL，大大减少了填料的用量并降低生产成本。● 耐受 0.5M-1.0M 的 NaOH 清洗，从而解决填料清洗不完全的问题，避免一些无法通过碱洗去除的杂质混入单抗原料中，同时延长填料的使用寿命。抗体是体外诊断试剂中最为常用原料之一。广泛应用于各类免疫诊断中。目前我国法规对该类原料的纯度并未给出明确的要求，但在实际临床应用中，原料中的残留杂质与人血清之间产生的非特异性反应在检测中出现了干扰检测甚至带来假阳性的结果。因此通过优化纯化工艺，最大程度提高单抗原料的纯度和均一性，对于诊断试剂的质量提升具有重要意义。抗体的纯化一般使用基于 Protein G 或 Protein A 的亲和层析，Protein G 和 Protein A 对于多种种属来源的多种亚型的 IgG 的 Fc 区域都具有高度的亲和性，可以用于腹水、血清、细胞培养上清等各种来源的

IVD 原料是整个 IVD 产业链中最为基础但关键的一环，在诊断试剂盒中有着至关重要的作用，原料的质量直接关系到诊断试剂的质量及稳定性。IVD 体外诊断原料主要有抗原与抗体；酶与辅酶以及其他原料三类。

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原料纯化生产解决方案

抗体纯化生产平台

抗体是体外诊断试剂中最为常用原料之一。广泛应用于各类免疫诊断中。目前我国法规对该类原料的纯度并未给出明确的要求，但在实际临床应用中，原料中的残留杂质与人血清之间产生的非特异性反应在检测中出现了干扰检测甚至带来假阳性的结果。因此通过优化纯化工艺，最大程度提高单抗原料的纯度和均一性，对于诊断试剂的质量提升具有重要意义。

抗体的纯化一般使用基于 Protein G 或 Protein A 的亲和层析，Protein G 和 Protein A 对于多种种属来源的多种亚型的 IgG 的 Fc 区域都具有高度的亲和性，可以用于腹水、血清、细胞培养上清等各种来源的抗体的纯化。

最新一代的 MabSelect PrismA 是诊断领域抗体纯化的理想选择，该填料基于 Protein A，具有以下不可替代的优势：

● 耐受 0.5M-1.0M 的 NaOH 清洗，从而解决填料清洗不完全的问题，避免一些无法通过碱洗去除的杂质混入单抗原料中，同时延长填料的使用寿命。

● 超高载量，6 分钟保留时间载量可达 80 mg/mL，大大减少了填料的用量并降低生产成本。

图 1a

图 1b

图 1a：在不同使用 cycle 使用 1.0M NaOH 处理 15 min 后不同的抗体纯化填料的相对结合载量；图 1b: 相比之前的产品，MabSelect PrismA 动态结合载量显著提高。

最新推出的 Fibro 超快速纤维层析技术则为高通量的抗体原料生产提供了新的选择。

Fibro PrimsA 具有和 MabSelect PrismA 相同的配基，因此在清洗和载量方面具有相同表现，而其独特的纤维层析技术在表现相同的情况下将实验流速提升了将近 20 倍，使每个生产循环可在 5 min 以内完成，最大程度节约了抗体原料的生产时间。

图 2：基于超快速纤维层析技术的 Fibro PrismA

在亲和层析后如有需要，可以使用凝胶过滤分子筛或离子交换对抗体原料进行进一步的纯化。

综上，抗体原料的纯化生产平台如下图所示：

图 3：抗体原料的纯化生产平台

抗原及酶类纯化生产平台

各种重组抗原及重组酶类在 IVD 原料中也占据着举足轻重的地位 抗原和酶类的纯化生产平台根据纯化路线主要分两大类：

1）基于标签亲和层析的重组抗原或重组酶类纯化生产平台

此类的重组抗原和重组酶类通过添加标签的形式，使用大肠杆菌或其他真核表达系统进行表达。主要纯化路线见下图：首先使用基于标签的亲和层析对原料进行初纯，之后根据需要使用凝胶过滤层析、离子交换层析或离子交换 凝胶过滤两步层析的方法对原料进行进一步的纯化。

图 4：基于标签亲和层析的重组抗原或重组酶类纯化生产平台

2）无亲和标签的抗原及酶类原料纯化生产平台

对于一些不带标签的或天然提取的抗原及酶类原料，可按照「CIPP」三步法，组合使用离子交换、疏水层析、凝胶过滤等技术完成纯化生产的过程。也可以将相应的抗体或有相互作用的分子偶联到预活化的填料上，制备成专用的亲和层析柱，之后对相应的抗原或酶类进行特异性的亲和层析纯化。常见纯化路线见下图：

图 5：无亲和标签的抗原及酶类纯化生产平台

3）使用预活化填料进行亲和层析纯化

预活化填料提前经过溴化氢、NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）或环氧树脂等物质处理，可以将含有氨基、羧基或羟基等基团的分子偶联在填料上，形成填料的配基，之后可使用相应偶联的配基的特异性纯化相应的原料 (除抗原和酶类，也可用于抗体原料的纯化)。常见的预活化填料见下图：

图 6：常见的预活化填料

化学发光标记物纯化生产平台

在化学发光免疫分析中，需要对抗原或抗体等分子进行标记进而得到相应的化学发光标记物，在标记完成之后，标记产物的分离纯化对化学发光试剂的质量及稳定性非常重要。分离纯化可将游离的标记物或游离的抗原/抗体，以及可能存在的不同的标记物形式进行去除，从而只保留比较均一的抗原/抗体-标记物。从而达到尽可能降低分析过程中的检测本底并避免出现假阳性问题，同时保证试剂的批间差最小化，保证试剂的稳定性。

使用凝胶过滤层析(SEC)进行标记物纯化

凝胶过滤层析根据生物分子大小及形状对其进行分离，样品加入凝胶过滤层析柱之后，在层析柱上进行分离，大分子先洗脱，小分子后洗脱。

● 高自动化：配合设备使用，可自动完成多个样品的纯化过程，节省时间和人力成本。

● 优重复性：层析方法可重复性好，纯化方法一旦确定，可保证不同批次纯化效果一致，从而保证试剂的批间差最小化。

● 全数据记录：整个实验过程的数据可被完整的记录。保证原料生产过程的可追溯性。

图 7. 凝胶过滤层析 (SEC) 示意图。

不同大小的分子进入凝胶过滤层析柱中之后，由于走的路径不同，流出的速度不同：分子量越大，走的路径越短，越早流出。

1) 小分子标记物纯化

● 用于直接发光平台或电化学发光平台

● 以吖啶酯、ABEI、三联吡啶钌等分子为标记物

● 标记物分子量较小

● 标记物与被标记的抗原/抗体分子量相差较大

● 可使用 Desalting 脱盐柱进行纯化

图 8. 使用 HiTrap Desalting 柱进行脱盐实验。

其中蓝色为蛋白紫外吸收峰（标记物纯化中此处指征标记了小分子的抗原/抗体），红色为 NaCl 电导峰（标记物纯化中此处指征游离的小分子标记物）。

2) 大分子标记物纯化

● 用于酶促发光平台

● 以辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等为标记物

● 标记物分子量较大

● 标记物通常与被标记物分子量相差较小

● 使用高分辨凝胶过滤（如 Superdex 系列凝胶过滤层析柱）进行纯化

图 9. 使用 Superdex 200 Increase 10/300 GL 蛋白分离结果图。

其中 1. 甲状腺球蛋白（669KD），3 mg/mL; 2. 铁蛋白（440KDa），0.3 mg/mL；3. 醛缩酶（158KD）3 mg/mL；4. 伴清蛋白（75KD） 3 mg/mL；5. 卵清蛋白（44KDa） 3 mg/mL; 6. 碳酸酐酶（29KD）; 3 mg/mL; 7. 核酸酶 A（13KD），3 mg/mL

随着近年来我国体外诊断市场的快速发展以及国家相继推出的各种鼓励政策，国内IVD 企业建立原料纯化生产平台，逐渐替代进口外采原料必将成为趋势，而在高效的原料纯化生产平台的建设中，Cytiva 必将时刻陪伴，为您提供最优的解决方案！