凝胶电泳检测原理图解，Analyser毛细管电泳仪进行序列多态性检测

凝胶电泳检测原理图解，Analyser毛细管电泳仪进行序列多态性检测7.矿物油（Mineral Oil），15ml（常温保存）6.75-400bp 范围内 DNA Ladder，1.0ml，用1XTE buffer 稀释，浓度为2ng/ul（-20℃保存）3. 5 X 930 双链 DNA Inlet buffer，125ml（4℃保存）4.5X 毛细管清洗溶液（Capillary Conditioning Solution）50ml（常温保存）5.35bp 和 500bp markers，3.2ml，Maker 用1XTE buffer 稀释，浓度为0.5ng/ul（-20℃保存）

毛细管电泳法用于分析片段长度在 35bp 至 500bp 范围内的双链 DNA，可以得到不同样品的长度及相对定量，可用于序列多态性检测、SSR实验等。

01DNF-900试剂盒成分：

1. FA 双链 DNA 胶，35-500bp，240ml（4℃保存）

2. 插入染料（Intercalating Dye），30ul（-20℃保存）

3. 5 X 930 双链 DNA Inlet buffer，125ml（4℃保存）

4.5X 毛细管清洗溶液（Capillary Conditioning Solution）50ml（常温保存）

5.35bp 和 500bp markers，3.2ml，Maker 用1XTE buffer 稀释，浓度为0.5ng/ul（-20℃保存）

6.75-400bp 范围内 DNA Ladder，1.0ml，用1XTE buffer 稀释，浓度为2ng/ul（-20℃保存）

7.矿物油（Mineral Oil），15ml（常温保存）

8.稀释 Buffer 1X TE （Dilution Buffer 1X TE），60ml（4℃保存）

02另外还需要买：

毛细管储存液，100ml

03软件：

Fragment Analyzer仪器控制软件

PROSize数据分析软件

04需要准备的仪器试剂耗材：

1.毛细管储存溶液，100ml

2.排枪、100μl枪和1000μl枪

3.枪头

4.96孔板离心器（用于离心样品板的气泡）

5.超纯水（用于稀释 5 X 930 双链 DNA Inlet buffer 和 5X 毛细管清洗溶液 （Capillary Conditioning Solution）和清洗实验用的 96 孔板）

6.1ml深孔96孔板（用于 Inlet Buffer和废液板）

7.量筒

05冲洗及养护：

1.每次实验前冲洗一次，实验后冲洗一次。在第六层（3）放入96孔板，每孔加入100ul毛细管储存液，一周换一次。每次用完后要将检测器降入第六层，机器运行过程中不可终止机器，每次开启需要降下第六层的板。

2. 开始冲洗模式。选择Capillary Conditioning-Add to queue ，载入默认处理（conditioning）模式，然后选择Edit选项。然后选择OK 。再选择一次OK将其载入到仪器队列。选择开始箭头。

实验前：

1.从冰箱中拿出分离胶和染料，使它们达到室温，现用现配，将分离胶和染料混合，每20ml胶加1.5μl染料。每天第一板时先做Full Condition，需要用25ml的胶，之后都用Gel Prime Only，每板使用5ml胶。混合好后倒入装gel1的瓶子中，将管子插入瓶子的底部。

2.拿出室温放置的毛细管清洗液，每80ml 超纯水加入20ml 5X 毛细管清洗液，摇动混匀，混合好后倒入装Conditioning的瓶子中，将管子插入瓶子的底部。

3.将超纯水倒入装gel2的瓶子中，将管子插入瓶子的底部。

4.倒掉废液瓶中的废液。

5.从冰箱拿出Inlet Buffer，放至室温，每80ml 超纯水加入20ml 5X Inlet Buffer。摇动混匀，将配好的Inlet Buffer加入第一层（B）的96孔板中，每孔加1.1ml

6.将 1 个空的 1ml 的深孔 96 孔板放入第二层（W）抽屉，这个板是毛细管的废液板，需要每次清空。

7. 在使用之前，将 marker 从冰箱拿出，使其温度达到室温。在分装之前摇动液体确保其充分混合，吸取30ul至样品板的每个孔，并覆盖 20ul 矿物油

8.打开Fragment Analyzer软件，点击 Solution levels，选择 Utilities—Solution Levels。这时候会弹出一个菜单，用于输入每个瓶子中溶液体积。

9.取一块干净的 96 孔板，吸取 22ul dilution buffer至样品孔的每一孔

10.吸取 2ul DNA 样品至样品板的每孔，使用移液器反复抽吸混匀，混合均匀之后，检查样品板的每个孔，确定每个孔的底部没有气泡

11. 拿出DNA Ladder 达到室温，吸取 24ul 的 ladder，把其加入样品板的 H12 孔

生成实验方法：

点击 Fragment Analyzer控制软件主界面的 Operation 标签，选择 Eidt Method。一旦生成及保存方法之后，可以不用编辑再次使用。一般步骤如下：1) Full Condition 冲洗方法，Gel Prime only（自动有效） 。Gel Selection：Gel 1.
2)Perform Prerun（有效） （5-8kV，30sec）3) Rinse（无效）4)Marker Injection（有效） 。电压注入（5-7.5kV，10 sec） 。这一步注入的是 35bp/500bp markers。5)Rinse（无效）6)Sample Injection（有效） ，电压注入（5-7.5kV，10 sec） 。这步注入的是准备好的样品。7)分离（有效） ，电压注入（5-8kV，60-80 min） 。这步执行的是毛细管电泳分离。

运行实验：

1.从Fragment AnalyzerTM仪器控制软件的主界面设置实验， 选择Operation 标签。左键SampleTray 的下拉菜单选择要分析的样品板的位置。2.点击鼠标左键选中样品孔来选择要运行的样品板。点击样品板的任意行，选择的行在板图中突出，在 Sample ID 下分别键入样品名称，左键点击孔，键入名称。

3.键入每行的样品信息之后，点击 Run Entire Tray 下面的 Add to queue。用户可以在弹出的表格中选择实验方法，输入注释。点击下拉菜单，选择合适的实验方法文件（预先设定的）。如果需要编辑方法，点击 Edit。最后点击 OK，添加方法至仪器的序列

4.重复以上步骤设置剩余的要分析的样品板。5.要运行的板选择添加之后，方法会排列在主屏幕的 Method Queue 下方

6.点击绿色三角开始运行下载到序列的程序。点击入口右面的“X”从队列中移去实验，点击右面的下拉菜单查看实验信息。点击每个队列的 Method Summary，查看实验方法的摘要。

分析数据：

安装软件

打开软件

设置工作路径

找到文件夹，点击当前文件夹

点击全局设置

点击load

找到所用的试剂盒，点击确定

点击apply

点击open

选中要查看的数据，点击open

查看样品方向是否正确

选择自动适合屏幕

选中大小校正

查看ladder是否线性，数值和数量是否正确，峰值有无判断错误，是否在H12孔，是否是point to point.假如不是，则需要进行相应更改，或加载之前正确的配置。下面的三个值，设为5 50 3

查看校正位置

点击reset，使红点全部处于峰值，然后把蓝色线拖到最低的红点下方紧挨。点击accept

点击gaussian fit

点击hide none-integrated peaks

选择一种marker校正模式使图像最好看

改变胶的颜色

调整粗细

导出图像

加辅助线

右键选中进行峰值的对比，查看一样的峰

右键删除多余的峰，使条带简化。还可以对误读的marker进行校正，方法是先add peak再set as marker，还可以导出峰图

还可以导出pdf

还可以导出数据

所有数据均已导出，包括图像，表格，原始数据及实验方法

其中Peak Table.csv可用于进行下一步的ssr分析