msi在结直肠癌中检测的意义：MOLCANCER

msi在结直肠癌中检测的意义：MOLCANCER研究思路全球范围内，结直肠癌（CRC）是第三常见的恶性肿瘤，并且是癌症死亡的第二大原因。尽管结直肠癌的诊断和治疗策略有了实质性的改进，结直肠癌患者的生存时间有所延长，但结直肠癌的死亡率仍然居高不下。由于缺乏有效的干预措施和精确的肿瘤生物标志物，迫切需要更好地了解大肠癌发生发展的分子机制。侵袭性癌细胞的一个特点是能量代谢，它包括糖酵解和乳酸发酵增强。尽管最近发现了m6A修饰与恶性肿瘤发生之间的关系，但m6A修饰在大肠癌中的作用和潜在的调控机制，特别是在大肠癌的糖酵解代谢中的机制仍鲜为人知。导读表观遗传改变涉及结直肠癌（CRC)发生的各个方面。m6A在人类多种疾病的发病机制中起着重要的作用。然而mRNA上的m6A修饰是否参与CRC的糖代谢尚不清楚。研究通过转录组测序和液相色谱 - 串联质谱法（LC-MS)发现m6A修饰与CRC糖代谢正相关，进一步通过体内外实验阐述METTL3通过稳定CRC细胞

『 MOL CANCER | m6A 依赖性糖酵解促进结直肠癌的进展 』

● 期刊：Molecular Cancer

● IF=10.679

● 发表时间：2020-04

导读

表观遗传改变涉及结直肠癌（CRC)发生的各个方面。m6A在人类多种疾病的发病机制中起着重要的作用。然而mRNA上的m6A修饰是否参与CRC的糖代谢尚不清楚。研究通过转录组测序和液相色谱 - 串联质谱法（LC-MS)发现m6A修饰与CRC糖代谢正相关，进一步通过体内外实验阐述METTL3通过稳定CRC细胞中HK2和SLC2A1 mRNA水平来充当癌基因并激活糖酵解途径的分子机制。迈维代谢提供m6A质谱定量检测和其他核酸修饰等代谢组学技术服务。

研究背景

全球范围内，结直肠癌（CRC）是第三常见的恶性肿瘤，并且是癌症死亡的第二大原因。尽管结直肠癌的诊断和治疗策略有了实质性的改进，结直肠癌患者的生存时间有所延长，但结直肠癌的死亡率仍然居高不下。由于缺乏有效的干预措施和精确的肿瘤生物标志物，迫切需要更好地了解大肠癌发生发展的分子机制。侵袭性癌细胞的一个特点是能量代谢，它包括糖酵解和乳酸发酵增强。尽管最近发现了m6A修饰与恶性肿瘤发生之间的关系，但m6A修饰在大肠癌中的作用和潜在的调控机制，特别是在大肠癌的糖酵解代谢中的机制仍鲜为人知。

研究思路

研究结果

首先对47例CRC患者样本进行RT-PCR，发现FDG的摄取量与METTL3的表达量存在显著差异（Fig1 a-b）。对其中一例样本进行分析也发现FDG的摄取量与METTL3的mRNA和蛋白表达量也存在显著差异（Fig1 c-e）。表明FDG的摄取和METTL3表达之间存在显著的相关性。LC-MS和m6A斑点实验显示，FDG的高摄取的样本中，其m6A修饰水平也高（Fig1 f-g）。为了确定METTL3在CRC糖酵解和肿瘤发生过程中是否起作用。敲除HCT116细胞中的METTL3基因，RNA-seq发现和糖酵解、葡萄糖运输、糖异生等途径相关的基因都下调（Fig1 h），代谢组学分析显示葡萄糖-6-磷酸、1 6-二磷酸果糖、丙酮酸和乳酸水平也降低（Fig1 i）。这些数据说明，METTL3可能介导CRC患者的糖酵解代谢和癌症进程。

敲除HCT116细胞中的METL3基因或者使用siRNA抑制其表达，结果显示糖酵解的代谢物、葡萄糖的摄取和酸化率都显著减少（Fig2 a-f）。在DLD1细胞中过表达METL3基因，结果显示糖酵解的代谢物、葡萄糖的摄取和酸化率都显著升高，而重组质粒的MTase结构域缺失后，则阻断了过表达METL3诱导的糖酵解（Fig2 g-i）。使用敲除METL3基因的HCT116细胞和过表达METL3基因的DLD1细胞构建CRC模型，以18F-FDG为分子探针，PET-CT显示，敲除METL3，降低了葡萄糖的摄取能力；过表达METL3，增强了葡萄糖的摄取能力（Fig2 j-k）。体内和体外实验证明，METL3通过其甲基化转移酶结合域调节CRC的糖酵解代谢。

敲除HCT116细胞中的METL3基因，细胞的增殖和克隆能力显著降低（Fig3 a-b）。在异种移植小鼠模型中，敲除METL3使得肿瘤的体积和重量显著降低（Fig3 c-e）。在DLD1细胞中过表达METL3，细胞的增殖和克隆能力显著增强，但是重组质粒的MTase结构域缺失后，则阻断了过表达METL3诱导的增殖和克隆能力增强的现象（Fig3 f-g）。在异种移植小鼠模型中，过表达METL3使得肿瘤的体积和重量都显著升高，但缺失MTase结构域后，肿瘤的体积和重量又回复到正常组水平（Fig3 h-j）。此外，2-DG处理在体外和体内都阻止了过表达METL3诱导的增殖和克隆能力增强的现象，体现在DLD1细胞活力降低、克隆能力降低、肿瘤体积和重量都降低等方面（Fig3 k-o）。

为了分析CRC中METL3 m6A水平升高潜在mRNA靶点，对HCT116细胞（WT和METL3敲除）进行m6A-seq分析，结果显示：敲除METL3后，m6A水平显著降低，且METL3结合位点大多存在于3’-UTR和5’-UTR（Fig4 a-e）。m6A-seq结果显示，敲除METL3后，m6A在转录水平整体减低（Fig4 f-g），且多数基因的表达水平发生了改变（Fig4 h），从中筛选出18个和糖代谢相关的基因列为潜在的靶基因（Fig4 i），检测HCT116细胞（WT和METL3敲除）中这18个基因的表达变化，发现其中6个基因下调，并且6个靶基因中有5个的m6A水平显著降低，最终进一步验证发现HK2和SLC2A1下调，细胞的乳酸产量显著减少（Fig4 j-l）。对临床CRC样本进行分析，发现METTL3高表达患者HK2和SLC2A1的m6A水平显著高于METTL3低表达患者，提示CRC患者HK2和SLC2A1 m6A水平的升高依赖于METTL3的修饰。

在HCT116细胞中敲除METTL3或使用siRNA沉默METTL3，HK2和SLC2A1 mRNA和蛋白水平都显著性降低（Fig5 a-b）；在DLD1细胞中过表达METTL3，HK2和SLC2A1 mRNA和蛋白水平都显著性升高，而重组质粒的MTase结构域缺失后表达水平又回复（Fig5 c）。检测细胞的己糖激酶活性，发现敲除METTL3其活性显著降低，过表达METTL3其活性显著性升高（Fig5 d-f）。构建了野生型和突变型HK2和SLC2A1荧光素酶报告质粒，结果显示敲除或抑制METTL3的表达荧光值显著降低，但对突变型荧光素酶报告质粒没有影响；过表达METTL3荧光值显著升高，去除METTL3 中的Mtase后荧光回复，但对突变型荧光素酶报告质粒没有影响(Fig5 g-i)。说明，HK2和SLC2A1为METTL3的靶基因。

ETTL3敲除降低了HCT116细胞中HK2和SLC2A1 mRNA的半衰期，说明METTL3诱导的HK2和SLC2A1水平上调部分是由于HK2和SLC2A1 mRNA转录本的稳定性增加所致。另外对m6A阅读器进行研究，发现敲除IGF2BP2可以降低细胞中HK2的mRNA水平，RIP实验表明IGF2BP2直接与HK2 mRNA的5‘和3’UTR结合；下调IGF2BP2/3可显著降低SLC2A1的mRNA水平，RIP实验表明IGF2BP2/3直接与SLC2A1mRNA的3‘UTR结合。综上：METTL3介导的m6A修饰分别通过IGF2BP2依赖和IGF2BP2/3依赖的mRNA稳定性调节增加HK2和SLC2A1(GLUT1)的表达。

在HCT116细胞中（WT和METTL3基因敲除）转染对照、HK2或SLC2A1过表达质粒转，发现敲除METTL3后，过表达HK2或SLC2A1，使得细胞增殖和克隆能力显著性升高（Fig6 a-b），而在异种移植肿瘤模型中，肿瘤的体积和重量也显著增加（Fig6 c-e），乳酸产量葡萄糖摄取量也显著增加（Fig6 f-h）。HK2或SLC2A1的下调显著降低了METTL3介导的DLD1细胞中较高的乳酸产量(Fig6 I)。SLC2A1的下调极大地削弱了METTL3在体外(Fig6 J)和体内(Fig6 K)诱导的DLD1细胞的高葡萄糖摄取。因此，HK2和SLC2A1在大肠癌细胞中介导了METLL3的调节功能。

临床样本显示METTL3高表达的样本显示HK2和GLUT1的染色很强 METTL3低表达的样本显示HK2和GLUT1水平较低（Fig7 a），并统计出METTL3的表达与HK2和GLUT1表达呈正相关（Fig7 b）。在大肠癌组织中，METTL3、HK2或GLUT1的高表达预示着较短的无病间隔，无论是作为线性变量(Fig7 c-e)还是作为分类变量(Fig7 f-h)。此外，在大肠癌中，METTL3、HK2和GLUT1的联合表达与治疗后复发的风险之间存在线性关系(Fig7 I)。三个高表达标志物METTL3/HK2/GLUT1的患者无病生存时间最短(Fig7 J)。

研究者猜测METTL3高表达的大肠癌患者对靶向METTL3的抗肿瘤药物更加敏感。为了验证这一预测，研究者用DAA(3-脱氮腺苷，一种内部N6-甲基腺苷的抑制剂)处理了表达较高METTL3水平的HCT116 CRC细胞。DAA对HCT116细胞增殖的抑制率为39%。相反，在METTL3表达较低的DLD1中，与相同剂量的DAA一起处理，只导致细胞增殖抑制20%( Fig7 k)。这些抑制结果也可以在体内重现。DAA对荷瘤HCT116细胞的裸鼠的肿瘤生长(Fig7 L-M)和瘤重(Fig7 N)的抑制作用比带DLD1细胞的裸鼠更有效。

综上所述：这些数据提示靶向METTL3的结直肠癌细胞可能比那些低表达METTL3的结直肠癌细胞更有效。

研究结论

通过转录组、生化和细胞生物学等技术证明了具有较高FDG摄取量的CRC患者，RNA m6A和RNA甲基转移酶METTL3表达高度增加。GSEA分析表明，CRC细胞中METTL3、细胞增殖和糖酵解途径显著富集。在培养CRC细胞和异种移植小鼠模型中，METTL3下调显著抑制了CRC肿瘤的生长和糖酵解进程。这些数据表明：METTL3和m6A甲基化水平是控制人类CRC侵袭性的决定性因素。此外，通过转录组m6A-seq分析和相应的功能验证表明：HK2和SLC2A1（GLUT1）是CRC中METTL3的关键靶基因。HK2和SLC2A1可能作为致癌基因促进细胞糖酵解代谢。靶向METTL3及其途径可能有望用于治疗具有高糖代谢的大肠癌患者。

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武汉迈特维尔生物科技有限公司（简称“迈维代谢”）位于武汉国家生物产业基地--光谷生物城，专注于提供领先的代谢组学技术开发及服务。迈维代谢创新了“广泛靶向代谢组”技术，基于“代谢组 基因组 转录组”多组学研究方案，近年来以通讯作者身份在Cell、Nature Communications 、Nature Genetics 、PNAS等国际学术期刊发表多篇论文，引领基因组时代的代谢生物学研究新方向。