抗体技术的发展阶段：治疗性抗体可开发性评估--基于生物信息学评估

抗体技术的发展阶段：治疗性抗体可开发性评估--基于生物信息学评估由于mAb的高度保守的一级结构和相似的高阶结构，公认的降解热点可以指导候选药物评估，以识别潜在的问题特征。例如，柔性CDR中的Asn和天冬氨酸（Asp）残基分别易于脱酰胺和异构化，因此需要更仔细的检查。可变域中聚集或更快清除与暴露的疏水性或带电斑块之间的相关性也可以应用于单克隆抗体候选物评估。这些通用原则可根据单克隆抗体候选物的氨基酸序列确定潜在风险。总结已经批准的单克隆抗体药物的表征参数，可以总结出低风险的质量属性（表1）。常规地，在动物模型中仅使用有限的标准（例如抗原结合和体内特性，包括安全性，药代动力学（PK）和药效学（PD））从早期发现到开发阶段选择单克隆抗体候选物。如果没有广泛的表征来了解所选候选物的生化和生物物理特性，问题可能出自意料之外的改变，稳定性或不良的PK和PD，这可能导致项目进度延迟甚至终止。开发风险通常与候选药物的内在特性有关。因此，在进入工艺开发之前进行可开发性评

可开发性简述

对抗体药物开发性评估的越来越多的关注，可以理解在早期对单克隆抗体先导候选物进行全面评估是可以避免后期开发期间的延误。可开发性的概念是基于成功开发大约80种市售抗体和Fc融合蛋白药物产品中获得的知识，以及过去三十年来从许多失败的开发计划中获得的经验教训。

至关重要的抗体质量属性，以及监测这些属性的传统和最新的分析方法，收集已有经验，提出了实用工作流程，作为可开发性评估的最佳实践：包括生物信息学评估，全面表征和使用适当的分析方法的强制降解。提供了有限的材料消耗和快速的周转时间。

单克隆抗体（mAb）治疗剂的发现和开发对资源的要求很高，并且在技术上具有挑战性。特别是，与化学，制造和控制（CMC）开发相关的挑战，例如高聚集，高粘度和易受化学降解的影响以及产品稳定性不足已得到普遍关注。

常规地，在动物模型中仅使用有限的标准（例如抗原结合和体内特性，包括安全性，药代动力学（PK）和药效学（PD））从早期发现到开发阶段选择单克隆抗体候选物。如果没有广泛的表征来了解所选候选物的生化和生物物理特性，问题可能出自意料之外的改变，稳定性或不良的PK和PD，这可能导致项目进度延迟甚至终止。开发风险通常与候选药物的内在特性有关。因此，在进入工艺开发之前进行可开发性评估至关重要。可开发性评估是用于系统评估候选药物的过程，包括结构评估和CMC，安全性，PK和PD以及可生产性（图1）。尽管许多相互依存的因素有助于mAb治疗药的成功开发，但选择具有良好生物物理和生化特性的候选药物有助于奠定坚实的基础。因此，可开发性评估的主要目标是严格评估单克隆抗体候选物的生化和生物物理特性，并选择具有最低开发风险的分子。

大量研究表明，评估单克隆抗体先导候选物的可开发性很重要。例如，不良的生物物理特性导致mAb的表达降低，不稳定或体内半衰期缩短。互补决定区（CDR）中连续的天冬酰胺（Asn）脱酰胺作用也导致了mAb效能的丧失。考虑到开发初期时间和资源的局限性，全面的可开发性评估可能无法消除以后可能发生的所有风险，但可以选择具有较低开发风险的潜在候选分子。同时，通过全面评估获得的知识也提供了坚实的基础，从而为工艺流程和配方开发提供了质量保证（QbD）的方法，以减轻任何剩余的已识别风险。当风险被认为是至关重要的且无法缓解时，早日做出重新设计分子的决定比后继决定更为可取，因为这可以使公司节省资源并避免时间表的过度延迟。

迄今为止，大约有80多种mAb和Fc融合蛋白药物产品已获得美国食品和药物管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的批准，并且有70多种产品处于后期开发阶段。

总结已经批准的单克隆抗体药物的表征参数，可以总结出低风险的质量属性（表1）。

由于mAb的高度保守的一级结构和相似的高阶结构，公认的降解热点可以指导候选药物评估，以识别潜在的问题特征。例如，柔性CDR中的Asn和天冬氨酸（Asp）残基分别易于脱酰胺和异构化，因此需要更仔细的检查。可变域中聚集或更快清除与暴露的疏水性或带电斑块之间的相关性也可以应用于单克隆抗体候选物评估。这些通用原则可根据单克隆抗体候选物的氨基酸序列确定潜在风险。

药物开发人员从工艺和配方开发中获得的内部知识在可开发性评估中也发挥着重要作用。稳定细胞系，细胞培养基成分和原料药工艺步骤的局限性是整个管道中可能存在的常见要素，应作为可开发性评估考虑的一部分。因此，我们建议进行总体可开发性评估（图1），重点是在早期评估生化和生物物理特性。

考虑到先前的建议，以下是评估结构和CMC的三步工作流程（图2）。步骤1是生物信息学评估，包括使用计算方法，基于氨基酸序列识别已知的降解热点。步骤2是进行深入全面表征，以实验方式评估关键的生化和生物物理特性，例如结构，稳定性，电荷分布，PTM，溶解度和疏水性。步骤3进行有限的强制降解研究，首先，进一步确认从步骤1和2中识别出的热点，其次，揭示未从步骤1中识别出的候选特定降解热点。强制降解研究还提供其他稳定性信息以对候选分子进行排名。可以同时执行步骤2和步骤3，以在短时间内全面评估单克隆抗体候选物。

生物信息学评估三类属性

我们建议根据mAb的一般特性（包括PTM和降解途径）将mAb结构特征分为三类（表2），即生物信息学评估中的引起问题属性，不必要属性和进一步考虑属性。问题属性已与已知的安全性或功效问题相关联。传统上，mAb前导选择不必研究进一步考虑的属性，但是如今对于具有改进的特性（例如最小的免疫原性，增强的稳定性和延长的半衰期）的下一代分子来说，则需要考虑这一属性。

问题属性

mAb候选物的问题属性主要包括CDR中的PTM，这些PTM会对效能，免疫原性和稳定性产生负面影响。单克隆抗体在细胞培养，纯化，储存甚至给药后都会经历PTM降解。在制造过程中暴露于各种压力条件下，例如高温（例如细胞培养，过程保持步骤），极端pH（例如，低pH蛋白A色谱洗脱或病毒灭活），搅拌（例如，细胞培养，泵送，混合，过滤或运输），剪切力（例如UF / DF）和环境光会加速降解。

Asn脱酰胺作用是mAb中最常遇到的降解途径之一，尤其是CDR中的Asn残基。Asn后面是小的且活跃的甘氨酸（Gly）残基（NG基序），很容易脱酰胺。另外，蛋白质结构可能对Asn脱酰胺作用有实质性影响，这已由以下情况证实：其中NG中没有Asn的Asn容易脱酰胺，而NG中的Asn抵抗脱酰胺的情况。CDR中的Asn脱酰胺作用可能导致抗原结合亲和力降低；因此，在施用于人后，CDR中的脱酰胺作用继续在循环中发生，导致效力丧失。因此，应在生物信息学评估中突出显示CDR中的Asn，然后是Gly，然后是丝氨酸（Ser），苏氨酸（Thr），并应在扩展表征和强制降解过程中对其进行评估，以确认脱酰胺作用。IgG在Fc中的所谓“ PENNY”环肽中还包含易感脱酰胺位点。在人类和内源性IgG中，mAb继续在该位点脱酰胺。由于该区域是受保护的区域，不会带来负面影响，因此在该地点进行脱酰胺处理不应该成为可开发性评估的考虑因素。

Asp异构化是mAb的另一种降解途径。与脱酰胺类似，CDR中的Asp残基通常易于异构化，尤其是Gly残基在其后面时。有报道Asp后面是His42或Ser47易发生异构化，这表明还涉及其他因素，例如残基灵活性，大小和结构。Asp的CDR异构化也可能导致抗原结合亲和力降低。在pH5左右有利于Asp异构化，因此在此常用pH范围附近在液体制剂中配制mAb具有挑战性。为了降低开发风险，应在生物信息学评估过程中突出显示Asp后面的Gly，后者是Asp或His，并在扩展的特性描述和强制降解期间进行进一步评估。

蛋氨酸（Met）和色氨酸（Trp）残基经常发生氧化。研究表明，重链CDR2中的Met以及构架区中的Met氧化不会影响抗原结合。但是，在较高的氧化水平或在对抗原结合更为关键的位置，可能会产生负面影响。已显示靠近CH2-CH3域界面和部分新生儿Fc受体（FcRn），蛋白A和蛋白G结合位点的两个保守Met残基易于氧化。这些Met残基的氧化导致热稳定性下降，聚集增加，补体依赖性细胞毒性（CDC）下降，与FcRn的结合亲和力下降以及体内半衰期缩短。已经报道了CDR中Trp残基的氧化，这可能导致效力降低，热稳定性降低和聚集倾向增加。由于犬尿氨酸的形成，Trp氧化还显示导致mAb溶液发黄。由于较高的Trp氧化与较高的溶剂暴露相关，因此CDR中的Trp残基预计更易氧化。总体而言，应仔细评估CDR中的Met和Trp，以确定它们的敏感性，并在必要时在加工和配制过程中实施适当的控制策略。

尽管罕见，但mAb在CDR中可能具有未配对的半胱氨酸（Cys）残基。未配对的Cys可以很容易地在细胞培养基中被游离的半胱氨酸修饰，这已表明会降低抗原结合亲和力。由于Cys侧链的高度反应性，应消除CDR或其他区域中不成对的Cys的候选分子。虽然重链CDR中两个Cys残基形成的二硫键提供了一些独特的表位识别特性，尽但未观察到对其稳定性和溶解性有影响。

除了在Fc区中保守的N-糖基化位点之外，mAb在可变域中具有N-糖基化的共有序列（NXS / T，X不能为P）。可变域糖基化显示出对抗原结合的可变影响，但对体内半衰期没有影响。可变域糖基化在以后的开发中就效力和可比性增加了另一水平的不确定性。Fab糖基化的末端半乳糖的较高水平，增加了通过α1，3-半乳糖和唾液酸化进一步半乳糖基化的可能性。与Fab相关的低聚糖加上α1 3-半乳糖（Gal）已显示出免疫原性。唾液酸化也可以添加N-羟乙酸神经氨酸（NGNA）的免疫原性部分。值得一提的是，α-1 3Gal和NGNA的添加高度依赖于细胞系，应使用预期的稳定细胞系中的材料评估其水平。生物信息学评估，尤其是使用计算方法时，也可以帮助识别不太明显的问题属性。由不常见氨基酸引起的mAb候选物的低表达和低稳定性是由统计序列分析确定的。CDR中的疏水氨基酸可导致单克隆抗体在生产过程中沉淀并吸收到过滤器中，并缩短体内半衰期。然而，另一项研究表明，不对称电荷分布以及较小程度的疏水性显着促进了所观察到的高粘度。这些疏水或带电荷的补丁在一级序列上可能并不明显，但通过使用各种计算方法进行适当的序列分析和结构模拟，这些可见或可见。扩展的特性描述和强制降级可以确认这些非显而易见的问题属性。

非必须属性

mAb的某些序列和结构特征会导致mAb异质性，但与任何生物学功能无关，并且不会引起安全性或功效方面的问题。这些属性的存在对具有一致轮廓的产品制造提出了不必要的挑战，并使分析方法的开发复杂化。N末端谷氨酰胺（Gln）的环化反应形成焦谷氨酸（pyroGlu）是mAb异质性的主要来源。该反应在原料药生产过程中自发发生，以液体制剂形式存储，并在生理条件下持续发生，并在存储过程中持续发生。这种N末端修饰对mAb的结构，稳定性或生物学功能没有影响。人内源性IgG的N末端Gln几乎完全转化为pyroGlu。已经提出用其他氨基酸替代N末端Gln以消除这种异质性来源。C末端赖氨酸（Lys）的不完全加工是另一种常见的修饰。 C末端Lys对mAb效价PK，PD或免疫原性没有影响。 但是，C末端Lys的去除显示出最佳的C1q结合和CDC。C末端Lys在循环过程中被快速去除，这说明其不存在于内源性IgG中。去除C端Lys的密码子可以消除这种异质性。

其它属性

用于治疗目的的单克隆抗体已经从鼠源进化为嵌合，人源化和完全人源的分子以降低免疫原性。然而，即使对于具有完整人类序列的mAb，免疫原性仍然是一个问题。设计了多种工具，包括计算机计算，体外测定或体内动物模型，以鉴定引起免疫原性的氨基酸序列。通过去除可变域糖基化位点，可以消除其他免疫原性成分，例如α1 3半乳糖。mAb治疗剂的聚集是免疫原性以及加工困难的另一个原因。已经尝试鉴定mAb中通过计算算法或实验筛选（例如噬菌体展示）介导聚集的区域，然后通过诱变提高mAb的稳定性。mAb治疗剂中的宿主细胞蛋白（HCP）也可以促进免疫原性。药物中HCP的类型和数量可能取决于特定的mAb序列或制造工艺条件，例如细胞系，细胞培养和纯化参数的严格性。但是，由于暴露的疏水性或带电斑块而具有更一般粘性的mAb，可能会遇到更多的HCP问题。通过皮下注射进行自我给药的mAb需配制为高浓度（≥100mg/mL），并以小体积（≤2mL）进行递送。就研发属性而言，高溶解度和低粘度是必须的。由于强烈的mAb自缔合通常是低溶解度和高粘度的原因，因此可以通过修饰蛋白质序列来减少自缔合，从而增加mAb的溶解度或降低粘度。除了先前讨论的可变域糖基化的潜在问题外，在聚集倾向区域（APR）附近引入糖基化位点还可以改善mAb的溶解度。通过改变FcRn结合位点周围的氨基酸序列或通过使用组氨酸（His）引入pH开关或破坏CDR带正电荷的贴片来改变CDR中的CDR，来探索体内半衰期的调节。另外，由于脱靶结合而具有快速清除的mAb可以通过改变氨基酸序列以破坏带电或疏水性补丁来解决。可以将单克隆抗体定制为具有延长的或缩短的半衰期，以更好地适合其治疗目的并增加患者的依从性，例如，更长的半衰期降低给药频率。

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