病毒的多步生长曲线，实验笔记病毒滴度及生长曲线测定

病毒的多步生长曲线，实验笔记病毒滴度及生长曲线测定（3）感染。吸出细胞培养基，将10-9梯度的病毒稀释液加入到96孔板的第九排，每孔100µL，6个或8个重复孔。10-8梯度的病毒稀释液加入到第八排，依此类推。空白对照加入100µL无血清Grace培养基。（2）稀释病毒。在10个1.5 mL无菌EP管中各加入900 μL无血清Grace培养基，在其外依次标明-1、-2……-9，最后一管作为对照。取100 μL待测病毒加入第一管中，旋涡震荡混匀，从中取100 μL再加入第二管，震荡后再取100 μL加入到第三管，依此类推，直至将第八管中100 μL加入到第九管中。采用终点稀释法测定病毒滴度（以96孔板为例）。（1）提前一天铺细胞。每孔接种5×103个细胞准备感染。

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TCID50，即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(cytopathic effect CPE)所需的病毒量，用以表征病毒的滴度。注意：这里的病毒量不是具体的浓度，而是将原始样品稀释的倍数。比如，1 mL培养液，稀释1000倍后恰好导致50%的细胞感染，则TCID50为 1000/mL。意思是每mL样品中含有的病毒导致50%细胞感染需要稀释的倍数。

滴度测定

采用终点稀释法测定病毒滴度（以96孔板为例）。

（1）提前一天铺细胞。每孔接种5×103个细胞准备感染。

（2）稀释病毒。在10个1.5 mL无菌EP管中各加入900 μL无血清Grace培养基，在其外依次标明-1、-2……-9，最后一管作为对照。取100 μL待测病毒加入第一管中，旋涡震荡混匀，从中取100 μL再加入第二管，震荡后再取100 μL加入到第三管，依此类推，直至将第八管中100 μL加入到第九管中。

（3）感染。吸出细胞培养基，将10-9梯度的病毒稀释液加入到96孔板的第九排，每孔100µL，6个或8个重复孔。10-8梯度的病毒稀释液加入到第八排，依此类推。空白对照加入100µL无血清Grace培养基。

（4）换液。2小时后将含有病毒稀释液的上清吸出，加入120-150µL有血清细胞培养基。

（5）27℃培养5-7天。

（6）通过倒置荧光显微镜下观察EGFP或mCherry表达（蛋白所带荧光蛋白），计算病毒滴度。

按以下公式计算出病毒的TCID50：TCID50/ml=10(a x)×200/ml 其中，a=lg(n)；n=感染率高于50%的最接近稀释度；b=n稀释度的感染率；c=低于n的最接近稀释度的感染率；x=(b-50%)/(b-c)。

绘制生长曲线（以24孔板为例）

（1）铺细胞。毎孔接种新鲜状态良好的细胞。

（2）准备病毒稀释液。以特定的感染复数感染细胞，计算并准备病毒稀释液。用培养基稀释病毒。

（3）感染。吸出细胞培养基，加入病毒稀释液。27℃吸附1小时后，吸出病毒，无血清Grace 漂洗细胞两次，再换成500 ul含血清的培养基，27℃培养。

（4）分别在感染后0，12，24，36，48，72和96小时，吸取上清，离心过滤，置于4℃备用。

（5）终点稀释法测定每个时相的病毒滴度。利用Excel绘制病毒生长曲线，下图为使用该方法所得生长曲线结果。