恶性和良性肿瘤在细胞学上的区别，Cell肿瘤内的异质性才是决定肿瘤免疫反应的关键

恶性和良性肿瘤在细胞学上的区别，Cell肿瘤内的异质性才是决定肿瘤免疫反应的关键关于为什么单克隆细胞系在体内无法生长而多克隆细胞系却能生长的一种假说是，在肿瘤生长过程中，多克隆细胞系的一部分细胞被杀死，而一部分细胞逃逸并形成了肿瘤。按照这个理论，多克隆细胞肿瘤在体内生长一段时间后会损失一定程度的异质性。而令人惊讶的是，UVB辐照过的黑色素瘤细胞系在体内生长的第7天到第17天中，亚克隆(subclone)的多样性并未出现任何变化，也就是说，黑色素瘤在生长过程中并没有一部分亚克隆被杀死。研究者们又从肿瘤中提出单克隆细胞，再次培养成单克隆细胞系，打入小鼠体内，发现这些单克隆细胞系的肿瘤增长非常缓慢。 为了进一步研究肿瘤内异质性的重要性，研究者们将黑色素瘤细胞系B2905进行UVB辐照并测序。和未经辐照的细胞相比，辐照过的细胞呈现出了更多的基因突变，并且产生了更多的亚克隆（也就是异质性增高）。有趣的是，相较WT细胞，辐照过的细胞在体外培养中的生长速度稍慢，可一旦注入小鼠体内，

免疫疗法在很多癌症临床中都取得了巨大的成功，然而还是有很大一部分癌症患者并不会从中获益，这其中的原因并不是非常清楚。突变负荷(tumor mutational burden)以及新生抗原（neoantigen）往往是人们考虑免疫疗法是否奏效的两大因素。一个非常流行的说法是，高突变负荷的肿瘤往往会有更多的新生抗原，因此更容易产生免疫反应。这个说法相当符合逻辑和直觉，然而事实上，免疫疗法对很多低突变负荷的肿瘤依然奏效，而且突变负荷程度并不能准确预测免疫疗法的功效。同时，在黑色素瘤中，新生抗原的呈递和肿瘤浸润T细胞的多少并没有呈相关性。这些证据都在指明，还有其它因素决定着肿瘤免疫反应。

近年来，肿瘤内异质性（intra-tumor heterogeneity）引起了越来越多的关注。这个异质性实际上就是肿瘤内亚克隆细胞群的多样性(clonal diversity)。和突变负荷不同的是，异质性反映的是细胞之间的基因差异。一个突变负荷很高的肿瘤可以有很低的肿瘤内异质性；而一个异质性很高的肿瘤也可以有很低的突变负荷。很多癌症的统计数据都显示，肿瘤内异质性越低，患者存活率越高。

2019年9月12日，来自以色列Weizmann Institute of Science的YardenaSamuels与美国NIH的Eytan Ruppin合作在Cell杂志上发表了题为UVB-induced tumor heterogeneity diminishes immuneresponse in Melanoma的长文，报道了关于肿瘤免疫的重大进展——通过一系列新型的体内实验，研究者们发现在黑色素瘤中，肿瘤内异质性越高，抗肿瘤的免疫反应就越容易被抑制，肿瘤生长得就更快。

首先，研究者们分析了TCGA黑素瘤患者的生存数据，发现突变负荷(mutational load)和拷贝数变异(copy number variation)的高低对患者的生存率并没有显著影响。有意思的是，肿瘤内异质性更低的患者生存率要明显高于异质性高的患者，这意味着异质性或许比其它因素更为重要。研究者们又对异质性的程度从1（最少）到6（最多）进行划分，发现那些肿瘤细胞单一的患者存活率最高，而随着肿瘤细胞多样性的增高，患者的存活率越来越低。研究者们又根据GranzymeA 和Perforin-1的表达对患者的免疫反应进行评估，发现肿瘤内异质性越小，免疫反应就越高。

为了进一步研究肿瘤内异质性的重要性，研究者们将黑色素瘤细胞系B2905进行UVB辐照并测序。和未经辐照的细胞相比，辐照过的细胞呈现出了更多的基因突变，并且产生了更多的亚克隆（也就是异质性增高）。有趣的是，相较WT细胞，辐照过的细胞在体外培养中的生长速度稍慢，可一旦注入小鼠体内，它的肿瘤生长速度要远远高于未经辐照的细胞。同样的结果也呈现在了另一个黑色素瘤细胞系B16F10.9中。为了将突变负荷和异质性这两种因素分开，研究者们从辐照过的B2905细胞中取出两个单细胞克隆(single cell clone)分别进行扩增并进行基因测序，研究者们发现这些单细胞克隆细胞系的异质性极低；同时，不同单克隆细胞系的突变负荷差异极大（有的单细胞克隆细胞系只有四千左右的突变，而有些则达到了将近一万七）。在两个单克隆细胞系分别被注入小鼠中后，它们形成肿瘤的非常小，并且在两三周之后就消失了。研究者们又用了额外二十个单细胞克隆细胞系在体内进行验证，也发现了同样的结果。这些结果证明，黑色素肿瘤的生长更多由肿瘤内异质性决定，而非突变负荷的程度。

关于为什么单克隆细胞系在体内无法生长而多克隆细胞系却能生长的一种假说是，在肿瘤生长过程中，多克隆细胞系的一部分细胞被杀死，而一部分细胞逃逸并形成了肿瘤。按照这个理论，多克隆细胞肿瘤在体内生长一段时间后会损失一定程度的异质性。而令人惊讶的是，UVB辐照过的黑色素瘤细胞系在体内生长的第7天到第17天中，亚克隆(subclone)的多样性并未出现任何变化，也就是说，黑色素瘤在生长过程中并没有一部分亚克隆被杀死。研究者们又从肿瘤中提出单克隆细胞，再次培养成单克隆细胞系，打入小鼠体内，发现这些单克隆细胞系的肿瘤增长非常缓慢。

为了研究这些肿瘤生长的差异是否由免疫导致，研究者们将WT B2905细胞、辐照过的细胞、以及源自于辐照过细胞的两个单克隆细胞系分别注射入严重免疫缺陷的小鼠(NSG)体内，发现在没有免疫系统的情况下，这些细胞皆可形成肿瘤，肿瘤生长速度也没有显著差异。这意味着是免疫反应导致了之前肿瘤生长速率的不同。因此，研究者们将注意力集中在了免疫系统完整的小鼠的肿瘤微环境中，分析了不同肿瘤之间浸润T细胞的差异，发现了UVB辐照细胞的肿瘤内的杀伤性T细胞较少，Treg最多，完全符合肿瘤增长速率的数据。此外，研究者们又鉴别了单细胞克隆细胞系的一些新生抗原(neoantigen)，并验证了其中的三个有很好的治疗效果。这个数据说明了辐照细胞的肿瘤中的确有可以帮助免疫系统识别的新生抗原，但却并不足以帮助免疫系统彻底杀死肿瘤细胞。

为了进一步研究异质性对于肿瘤生长的影响，研究者们给先前20个单克隆细胞系画了系统发生树(phylogenetic tree)，鉴别了6个节点（下图里树上的8 10 6 7 4 9)。研究者们先随机混合了来自三个不同节点的单克隆细胞系，一共四组，分别注射入小鼠体内，发现三个不同克隆的混合体并不足以形成肿瘤（下图左）。接下来，研究者们把混合的克隆数量增加到了6个(6AB)以及12个(12AB)，并用来自同一节点的单克隆细胞系混合体(6WB和12WB）作为对照。结果发现，随着不同节点的克隆数量增加，肿瘤的生长速率越快（下图中、右），再次验证了研究者们的假设：肿瘤内异质性决定了肿瘤的增长。最后，研究者们分析了经过PD-1抗体或CTLA-4抗体治疗的患者生存率，发现肿瘤内异质性越低的患者生存率就越高。

总而言之，通过一系列体内实验以及系统分析，研究者们发现在黑色素瘤中，相比其他因素（突变负荷、CNV），肿瘤内的异质性对肿瘤生长起到了更为决定性的作用。至于为什么异质性高的肿瘤会抑制免疫反应，一种可能是因为在异质性高的肿瘤内，亚克隆上的新生抗原被稀释了，不足以引起击退肿瘤生长的免疫反应。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.08.032