酶分子修饰的原理：Nat. Commun.

酶分子修饰的原理：Nat. Commun.首先，对于Ce-FMA的类磷酸酶活性探究，选择有机磷——pNPP和BNPP作为底物进行实验。与碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ALP）相似，Ce-FMA-FA-20-RT的活性表现出pH依赖性。由于ALP能将磷酸化合物(即焦磷酸盐)转化为游离磷酸盐，实验进一步测试Ce-FMA-FA-20-RT对生物磷酸盐（AMP、ADP、ATP和β-甘油磷酸盐（β-GP））的水解活性。结果表明，Ce-FMA-FA-20-RT对ADP和ATP的水解活性优于AMP和β-GP，这可能与ADP和ATP中含有更多的磷酸键有关（图2）。基于数据分析的结果，选择高价态、硬路易斯酸离子（Zr4 ，Ce4 和Hf） 富马酸（fumaric acid FMA）和调节剂来构建一种具有多种水解酶活性的UiO-66型MOF材料。通过对不同材料以及不同反应条件下合成的Ce-FMA的类磷酸酶活性的比较，筛选出

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*本文首发于“纳米酶Nanozymes”公众号，2022年7月1日

*编辑：俞纪元

纳米酶是一种具有类酶活性的纳米材料，与此同时，它具有优于天然酶的环境耐受性与长期稳定性。近些年来，纳米酶领域的论文数量呈指数型趋势增长。其中，有关氧化还原型纳米酶的论文数量占大多数（92.9%），而水解型纳米酶的发展则受限于其多样的底物以及复杂的催化机理。因此，设计高效的水解型纳米酶可以在一定程度上完善纳米酶所能模拟的酶种类，这对于纳米酶领域的发展至关重要。

南京大学魏辉教授课题组的李思蓉博士基于数据的启示，应用两种策略从数据出发，设计出一种具有优异催化活性的水解型金属有机框架（metal-organic framework MOF）基纳米酶。策略的第一步是通过微调MOF中金属团簇的路易斯酸来增强其活性，第二步则是通过缩短配体的长度来提高活性位点的密度，从而有效提高MOF材料的整体活性（图1）。

图1. 水解型纳米酶的数据统计及分析。（a）不同种类的纳米酶及其占比；（b）四种水解型纳米酶相关材料的研究发表数量统计；（c）不同材料的类磷酸酶活性半反应时间的统计图；（d）不同材料的类磷酸酶活性半反应时间及其对应底物的统计热图；（e）根据硬-软-酸-碱理论绘制的元素周期表；（f）锆基MOF材料的半反应时间与其孔径的关系。

基于数据分析的结果，选择高价态、硬路易斯酸离子（Zr4 ，Ce4 和Hf） 富马酸（fumaric acid FMA）和调节剂来构建一种具有多种水解酶活性的UiO-66型MOF材料。通过对不同材料以及不同反应条件下合成的Ce-FMA的类磷酸酶活性的比较，筛选出Ce-FMA-FA-20-RT作为最优材料，用于后续研究。

首先，对于Ce-FMA的类磷酸酶活性探究，选择有机磷——pNPP和BNPP作为底物进行实验。与碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ALP）相似，Ce-FMA-FA-20-RT的活性表现出pH依赖性。由于ALP能将磷酸化合物(即焦磷酸盐)转化为游离磷酸盐，实验进一步测试Ce-FMA-FA-20-RT对生物磷酸盐（AMP、ADP、ATP和β-甘油磷酸盐（β-GP））的水解活性。结果表明，Ce-FMA-FA-20-RT对ADP和ATP的水解活性优于AMP和β-GP，这可能与ADP和ATP中含有更多的磷酸键有关（图2）。

图2. Ce-FMA-FA-RT-20对AMP ADP ATP和β-GP的类磷酸酶活性。

接下来，对Ce-FMA的类蛋白酶活性进行了探究，实验选用牛血清白蛋白（bovine serum albumin BSA）作为底物。采用凝胶渗透色谱法（GPC）监测Ce-FMA对BSA的水解过程，在60°C和37°C的条件下，34-36 min时BSA对应的峰逐渐减小，表明BSA被逐渐水解。为了获得确切的水解片段的分子量并确定其可能的水解位点，实验进一步采用电喷雾电离质谱（ESI-MS）进行分析。结果显示，在水解过程中，裂解片段的分子量为699-4764 Da，由6-41个氨基酸组成；在经过36 h的反应后，得到6-12个氨基酸片段，其长度与天然蛋白酶相同；精氨酸（R）、赖氨酸（K）和天冬氨酸（D）是三个主要的剪切位点，且切割位点位于BSA的表面，表明BSA的表面与Ce-FMA-FA-20-RT之间存在一定的相互作用。（图3）

图3. Ce-FMA-FA-RT-20对BSA的类蛋白酶活性。（a-b）Ce-FMA-FA-RT-20分别于60℃和37℃条件下对BSA的水解GPC谱图；（c）于不同时间点采集的Ce-FMA-FA-20-RT水解BSA的碎片数量与质量关系图；（d-e）对应于（a-b）图的BSA水解转化率；（f）碎片数、特定末端碎片数占比与时间的关系；（g）Ce-FMA-FA-RT-20与BSA反应24 h后的BSA肽链碎片序列图；（h）水解后带有R、K和D末端的片段在BSA的表面分布示意图（PDB代码：6QS9）；（i）水解后带有R、K和D末端片段的占比；（j）R、K和D的化学结构式及其侧链的pKa值；（k）D-和D 端水解机制示意图。

此外还对类糖苷酶活性进行研究，首先选择两种显色底物（2-硝基苯β-D-半乳糖苷和4-硝基苯N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷）进行实验，结果表明，Ce-FMA-FA-20-RT对4-硝基苯N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷的水解效率高于2-硝基苯β-D-半乳糖苷。随后，进一步应用离子色谱法研究Ce-FMA-FA-20-RT对均不含乙酰氨基的麦芽糖α-1 4糖苷键和乳糖β-1 4糖苷键的水解情况。然而，后续的分析中没有发现单糖裂解产物。这些结果表明，良好的离去基团有利于Ce-FMA-FA-20-RT对2-硝基苯β-D-半乳糖苷和4-硝基苯N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷的水解。由于羧甲基壳聚糖可能与Ce团簇配位，从而降低吸附能，因此实验继续选择羧甲基壳聚糖作为底物进行探究。用GPC和折射率检测器（RID）测定羧甲基壳聚糖的水解产物。GPC结果表明，Ce-FMA-FA-20-RT能够分别于37°C和60°C的碱性条件下水解羧甲基壳聚糖。总而言之，Ce-FMA-FA-20-RT更倾向于水解含（1）能够降低吸附能的基团;（2）能够降低解吸能的基团(如2-硝基苯和4-硝基苯)的葡糖苷酸衍生物。

图4. Ce-FMA-FA-RT-20的类糖苷酶活性。（a-b）对2-硝基苯β-D-半乳糖苷和4-硝基苯N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷的水解及检测原理示意图；（c）不同pH条件下4-硝基苯N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷水解产物在405 nm处的吸收值（于60℃下反应8 h）；（d）在pH为10.0条件下，4-硝基苯N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷水解产物在405 nm处的吸收值变化（于60℃下反应5 h）；（e）Ce-FMA-FA-20-RT与羧甲基壳聚糖在37℃或60℃条件下反应的GPC谱图（pH=8.0）。

通过上述的研究，Ce-FMA-FA-20-RT已被证明可以水解含有磷酸酯键、酰胺/肽键和糖苷键的几种底物。因此，进一步探究Ce-FMA-FA-20-RT对含有上述几种键的物质的混合物，即生物膜的水解作用。生物膜能够为细菌提供庇护所，并能为其提供营养物质，使得生物膜内的细菌具有不同于浮游细菌的特性，从而限制了抗菌类药物对生物膜内细菌的杀伤作用。应对生物膜的难处在于它含有多种成分:如多糖/磷酸乙醇胺纤维素、蛋白质、核酸和脂质。通过散射电子显微镜（SEM）、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和结晶紫染色结果观察（图5），Ce-FMA-FA-20-RT对生物膜具有一定的水解作用。

图5. Ce-FMA-FA-20-RT对生物膜的水解作用。

总而言之，本篇工作通过系统分析已发表的105篇纳米酶领域的相关论文，得知MOF是一种优良的模拟酶，并且金属团簇的路易斯酸度和配体所调节的活性位点密度是影响其活性的两个关键因素；基于数据分析结果，实验构建了一种UiO-66型的MOF材料——Ce-FMA，并发现其具有优异的类磷酸酶、类蛋白酶以及类糖苷酶活性，能够有效降解生物膜。目前有关水解型纳米酶的研究仍较少，更多关于水解型纳米酶的化学信息亟待分析、探究，如配位网络的拓扑结构、底物的孔径以及相关官能团的修饰等。我们相信，随着纳米酶领域的快速发展，在不久的将来，机器学习和其他人工智能技术将有望用于设计和发现新型纳米酶。

该工作以“Data-informed discovery of hydrolytic nanozymes”为题目发表于Nature Communications。论文第一作者为南京大学现代工程与应用科学学院博士李思蓉，通讯作者为南京大学魏辉教授。感谢南京大学铁祚庥老师、华中科技大学万翠红教授、中国药科大学刘玮副教授、武汉大学崔然副教授、南京大学（现中科院过程工程研究所）张会刚教授、中科院长春应化杜衍研究员等的帮助。

撰稿：周子君

审阅：周一敏

编辑：王嘉正

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原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-022-28344-2