项目化学习与stem学习：渐行渐近的MSCs的3D培养

项目化学习与stem学习：渐行渐近的MSCs的3D培养MSCs目前在许多临床试验中被应用，以研究其在免疫调节、支持造血和组织再生中的潜力。因此，开发一种快速可靠的体外扩增方法来满足规模化的细胞剂量是必需的。修订：步步先生正文干细胞微环境是干细胞赖以生存的基础，对调控干细胞命运具有重要的作用。撰文：东海先生

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正文

干细胞微环境是干细胞赖以生存的基础，对调控干细胞命运具有重要的作用。

撰文：东海先生

修订：步步先生

首发：间充质干细胞

MSCs目前在许多临床试验中被应用，以研究其在免疫调节、支持造血和组织再生中的潜力。因此，开发一种快速可靠的体外扩增方法来满足规模化的细胞剂量是必需的。

目前，微载体已被广泛用于各种生物技术应用，已经成为干细胞扩增和分化的一种新方法。干细胞在微载体上的有效扩增和分化，依赖其调节细胞形状和形成组织的能力。由于微载体的多样性，利用特定微载体的合理设计，可能为规模化细胞制备提供均一稳定的制剂来源。

1 生物反应器一览

生物反应器，可作为体外培养的平皿或烧瓶的替代品。简单的搅拌容器，旋转瓶，提供了比其他培养器皿更有吸引力的优势，例如提供具有可扩展性和均匀性的最低浓度梯度(pH，溶解氧，代谢物)。当细胞与微载体相结合培养时，可在搅拌条件下固定并培养贴壁细胞，这无疑是最有效技术之一。在使用低血清培养基（2%的FBS）的情况下，微载体法扩增培养BMSCs是普通培养效率的8倍。

生物反应器主要类型有：搅拌悬浮式生物反应器、旋转式生物反应器和灌注式生物反应器。

搅拌悬浮式生物反应器

目前，以旋转瓶(SF)为原型的搅拌悬浮式生物反应器(SB)主要用于MSCs的大规模生产，搅拌臂将培养基在培养瓶中搅拌混匀。

旋转式生物反应器

旋转式生物反应器(RWV) 使得剪切力均匀分布，减少了3D细胞培养中的异质剪切力和湍流。该设计包括带有气体交换膜的圆柱室，其中容器主体绕其轴线旋转。如果进行BMSCs扩增，可保持其分化能力。然而，也有其不足之处，其支架在尺寸上受到限制，剪切力分布不均匀，并且易发生碰撞。

灌注式生物反应器

生物反应器也可以灌注式，可连续交换介质，在排出介质的同时引入新鲜介质。灌注生物反应器由平行板、中空纤维、固定床和流化床生物反应器组成。MSCs可单层附着在填充床表面上，灌注式生物反应器为细胞生长提供了一个连续的表面积，但必须在低流速下灌注。

平行板生物反应器，可以用于大规模培养BMSCs和具有成骨潜能的祖细胞。与其类似，中空纤维生物反应器可以连续灌注模式运行，并提供低剪切力环境。其特点是，具有用于细胞培养的表面积，由一束平行的中空纤维束组成，包封在圆柱形的筒内，具有用于介质流动和围绕纤维的气体交换的无菌闭合回路。中空纤维生物反应器和固定床生物反应器也存在着缺点，在可扩展性、培养监测和细胞收获方面都存在困难。

2 3D培养的载体：微载体

说完了3D培养体系，再说一说3D培养的载体：微载体。微载体培养的ADSC和UCMSC，显示出较低的衰老，表达了更高的生长因子，显示出更强的迁移能力和促进愈合能力。微载体法获得的MSCs，免疫抑制能力同样得到增强。与2D培养相比，微载体法培养的MSCs更小，能更有效地分布到组织中。微载体法培养的MSCs，由于有一定的MSCs相互聚集，从而增强了它们的抗炎特性，而且高表达三种抗癌蛋白：IL-24、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）和CD82。

基于微载体的3D培养，微载体通常是球形的颗粒，可为细胞粘附和增殖提供更大的表面积。不同的微载体具有独特的物理性质，如硬度和纳米拓扑学，并可用各种材料制备（明胶、葡聚糖、聚苯乙烯和海藻酸盐）。可为无孔(SoloHill®塑料微载体)，大孔(CultiSpher®-S)，或微孔(Cytodex®-1)。

各种天然和合成聚合物材料已被用于干细胞培养的商用微载体的骨架成份，包括葡聚糖，明胶，纤维素，聚苯乙烯，塑料，聚酯，羟基化甲基丙烯酸酯，还有聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），海藻酸盐，和壳聚糖。微载体骨架还可以与其他化合物交联，例如与带阳离子的基团交联（DEAE）或其他细胞外基质（明胶和胶原），以增强细胞粘附。

微载体的生物模量和刚度也很关键，但大多数微载体缺乏生物力学表征。大多数微载体，来源于原料(即葡萄糖、苯乙烯、明胶等)的交联或聚合，具有不同程度的刚性。除了ECM外，微载体材料的化学组成和力学性能也影响MSCs的形状和分化。

因此，不同的微载体可能具有不同的生物力学特性，用以调节干细胞的增殖和分化。

3 微载体的粘附性

微载体与血清中的粘附分子有差异地结合。微载体影响纤维连接蛋白或层粘连蛋白（ECM的重要成份）的吸附。MSCs表达特定的整合素与ECM相互作用，可调节MSC的粘附和增殖。最适合MSCs增殖的ECM是来自骨髓基质的基质蛋白（I型胶原和III型纤维连接蛋白）、骨基质（I型胶原）、内皮基底膜（IV型胶原和层粘连蛋白），和血清（纤维连接蛋白和玻璃粘连蛋白）。

在明胶微载体(Cultispher S)上预涂了FBS，并建立了适当的补料制度，第8天达到最大细胞密度4.2×10⁵个/mL，细胞总数增加8.4±0.8倍；而且扩增的MSCs保留了其成脂和成骨的潜能，以及克隆形成的能力。

微载体表面可以附着细胞因子，或者在细胞接种之前，将其与培养基孵育。考虑到不同来源的MSCs表达特定粘附分子的不同，微载体、表面涂层和培养基的最佳选择取决于要扩增的MSCs的类型。

4 微载体的培养方案

利用微载体开发MSCs制备方案时，要考虑其培养条件，以便细胞在从一种微载体上到另一种微载体上。可随时添加新鲜的微载体，以便为细胞持续扩增。相对于传统平面培养体系，微载体培养有诸多优势，不需要传代培养，减少了一些操作，同时也降低了成本。

为了保证MSCs扩增所需的营养，降低代谢物水平，需要周期性更换培养基。由MSCs产生的细胞因子在扩增中也具有决定性作用。因此，虽然需要定期加入新培养基和降低不利的代谢产物，但由此也可能会去除或降低这些有益的细胞因子。工艺开发时应该考虑到。当每隔3天进行一次半量换液，再添加30%的含微载体的新鲜培养基时，BMSCs的增殖率最高。

粘附期的持续时间和搅拌方案也是在各个实验大不相同。事实上，这一步是在静态的条件下进行的，或低速搅拌后静置。但也有人在细胞粘附期（24h），使用连续搅拌方案，促进了UCMSC与微载体的粘附。

纯化过程包括从微载体中收获细胞，浓缩，洗涤。微载体的选择，仅适于最佳的细胞粘附和生长。在培养期结束后收获细胞，同时控制最终细胞悬浮液中的微载体水平，还是很困难的。

从微载体收获MSCs，大多都依赖于酶制剂，通常使用猪源性胰蛋白酶EDTA或TrypLE™Express/Select(Gibco)。然而，由于酶会损害细胞的表面标记物，从而可能改变细胞生物学效力，因此需要确定最佳酶浓度和孵育时间。

如果使用热敏微载体，可以从微载体更温和收获MSCs。在细胞收获后，需要去除微载体。大多数微载体比MSCs大，可以过滤分离。也可以开发可溶性微载体。由于临床设计常常需要大量的细胞。因此，需要多次洗涤富集MSCs，以便满足其临床需求（MSCs输注或注射）。

5 文末小结

MSCs的3D培养法，在培养扩增效率方面远胜传统的2D培养法，减少了人员操作带来的意外风险，降低了成本，是将来细胞培养的一个方向。3D培养刚刚起步，尚需要时间的积累和验证。

3D培养未来可期，一定会助力MSCs大规模培养的自动智能化生产。

周红梅：临床级干细胞库的建设与管理

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