纳米抗体制备教程（天然的单域抗体）
纳米抗体制备教程（天然的单域抗体）图1 Schematic representation of naturally occurring antibodies in sera of camelids 骆驼科家族包括骆驼 (单峰Camelus dromedaries 和 双峰Camelus bactrianus) 美洲驼(Lama glama 和 Lama guanicoe) and 小羊驼 (Vicugna vicugna 和 Vicugna pacos)。骆驼是胼足亚目唯一现存的家族，胼足亚目、反刍动物（牛、山羊、绵羊、羚羊等）和羊蹄目（猪和河马）共同构成偶蹄目。虽然所有骆驼族的血清都有HCAbs，其他偶蹄目如羊蹄目和反刍动物没有功能性的HCAbs。但是在病理性疾病的病人血清和小鼠杂交瘤中发现存在基因缺失的VH和CH1的HCAbs，这些HCAbs由于缺失VH和CH1而不能与抗原结合。值得一提的是缺失轻链和CH1会导
骆驼血清包含常规异四聚体抗体和仅有重链的HCAb抗体。这些HCAb包含VHH区和两个恒定区。HCAb之所以没有轻链是由于缺乏和轻链互作的前端VHH和第一个恒定区。尽管HCAb的基因元件已经研究清晰，但是这些专有的基因在体内如何形成结合特定抗原的抗体并完成亲和力成熟的具体机制仍未知。目前，通过鉴定识别特定抗原的VHH以及基于多种晶体结构数据总结出单域抗体具备一些有利的生化和经济特性（如大小、亲和力、特异性、稳定性和生产成本），进而推动了这些单域抗体工程化应用于实验研究、生物技术和医学。
1简介
免疫球蛋白抗体IgG总体上的由两条相同的重链和两条相同的轻链组装而成（图1）。轻链包含两个结构域，重链包含四个结构域。抗体的轻链和重链N端的可变区VL和VH是不同的，VH-VL的不同构成了抗体识别抗原的多样性。抗体轻链和重链的恒定区CL和CH是保守的。重链剩余的两个CH可以招募如巨噬细胞和自然杀伤性细胞的免疫细胞或引起补体激活的效应功能。
骆驼的血清中有与常规免疫球蛋白不同的只有重链的HCAbs抗体。HCAbs缺失了轻链以及重链的CH1（图1）。HCAbs的重链同源二聚体可变区称为VHH的结构和功能与IgG的Fab类似。
骆驼科家族包括骆驼 (单峰Camelus dromedaries 和 双峰Camelus bactrianus) 美洲驼(Lama glama 和 Lama guanicoe) and 小羊驼 (Vicugna vicugna 和 Vicugna pacos)。骆驼是胼足亚目唯一现存的家族，胼足亚目、反刍动物（牛、山羊、绵羊、羚羊等）和羊蹄目（猪和河马）共同构成偶蹄目。虽然所有骆驼族的血清都有HCAbs，其他偶蹄目如羊蹄目和反刍动物没有功能性的HCAbs。但是在病理性疾病的病人血清和小鼠杂交瘤中发现存在基因缺失的VH和CH1的HCAbs，这些HCAbs由于缺失VH和CH1而不能与抗原结合。值得一提的是缺失轻链和CH1会导致大斑猫鲨、须鲨和斑点鼠鱼的发生。这些称为Ig-NAR的HCAbs抗体有识别抗原的V-NAR区。虽然V-NAR与骆驼HCAbs的可变区是不同的，但是他们显示出惊人的结构和趋同进化。
由于HCAbs只有一种可变区，所以骆驼被免疫后，克隆血液中循环的B细胞再通过噬菌体展示可以直接鉴定与特定抗原结合的VHHs。VHH由于相对分子质量小又称为纳米抗体或单域抗体。这篇综述里我们总结了HCAbs和VHH的主要结果特征并且更新了骆驼中可能产生HCAbs的机制。此外，我们还综述了纳米抗体广泛应用于实验研究、生物科技和医疗方面的生化基础。
图1 Schematic representation of naturally occurring antibodies in sera of camelids
2HCAb和纳米抗体的结构特征-骆驼族中HCAbs的亚型
2.1 重链抗体和纳米抗体
HCAbs缺失轻链和CH1区是其区别于IgG的显著特征。因此，HCAbs的大小约为90KD小于150KD的IgG。HCAbs更紧凑的结构可能使其更容易接触到隐藏的抗原。相反地，一个HCAb中两个VH相距较近可能使其可以交联抗原，虽然推测IgG2由于铰链区存在脯氨酸-谷氨酰胺重复序列形成类似于CH1的间距。
骆驼血清中HCAbs在IgG中的比例一般为50-80%，但是在北美的一些骆驼品种中，HCAbs的比例为10-25%。这说明HCAbs在骆驼的免疫中有重要作用。骆驼循环的血液中存在一些缺失轻链的IgG亚型，但是由于难以纯化得到均匀一致的亚型以及区别不同的亚型以致于不能得到全部的IgG亚型。通过Protein G和Protein A亲和层析的方法可以区分异四聚体和同二聚体。常规的异四聚体可以从Protein G柱子在低PH条件下洗脱下来，单峰骆驼不结合Protein G但是结合Protein A的IgG经控制pH可以将IgG2a和IgG2b分别洗脱下来。研究者发现这些IgG中可能含有其他IgG亚型。通过这种方法发现llama血清中有两种异四聚体亚型，并且可能存在三种IgG2和两种IgG3亚型。
通过分析单峰骆驼B细胞中的IgG cDNA发现其存在两种常规IgG亚型，HCAbs有很多种亚型。多种cDNA序列仍需进一步鉴定并区分亚型。牛中有三种IgG亚型，猪中有六种IgG亚型，这些IgG亚型不能通过Protein A或Protein G亲和层析的方法分开。
人和小鼠抗体的研究证实了并区分了IgG的亚型的功能。虽然骆驼中IgG的确切的角色和功能研究还处于初期，未感染或者免疫的动物会产生三种IgG亚型（在不同动物中会不同，取决于免疫原）。在llama中很明显的是IgG1和IgG3可以中和西尼罗河病毒，而IgG2在这方面的作用很弱。但是这三种亚型的IgG都已结合单核细胞和巨噬细胞，说明它们都可以招募免疫细胞。
2.2 VHH的结构
V区多样性的序列存在于高变区HV中，HV周围是更保守的FR区图2。V区折叠结构含有9个β折叠（A-B-C-C’-C’’-D-E-F-G)即A-B-C-C’通过loop以及与Cys23和Cys94之间的二硫键与C’’-D-E-F-G构成，HV区由B-C C’-C’’ F-G形成的H1-H3三个loop构成。N端连续的结构形成与抗原表位互补的称为互补决定区CDR。虽然loop的序列是多变的，但是除了H3之外其余loop的长度是比较保守的。H1和H2中的Cα处在固定的位置。很明显，在人和鼠的VH结构中没有所谓经典同意的loop结构，loop结构的组合是有限的。因此，Loop的长度和关键氨基酸就可以预测其实际的结构。常规的抗体有并列的各有三个VH loop的VH和VL形成600–900埃的平台。总的来说，常规的抗体形成空腔、凹槽或平面(个别氨基酸有轻微波动酸侧链伸出)分别识别小分子、线性肽段和如蛋白等比较大的抗原。
氨基酸序列比对发现VHH与VH的FR和HV区高度相似，只在FR2和CDR区有一些不同。在FR2中，VH中与VL相互作用的重要疏水氨基酸Val47 Gly49 Leu50 Trp52在VHH中被更小的或亲水的氨基酸Phe42 Glu49 Arg50 Gly52取代。小鼠的VL缺失会造成抗体的粘性增加，而将其VH的FR2中的氨基酸替换成骆驼VHH的氨基酸则会增加抗体的可溶性。但是，这种改造会造成实际的二聚体结构变化。值得一提的是将单链可变区ScFv中前端的VH和VL进行突变被用作筛选最好的解决办法（如表达、聚合状体和热稳定性）。氨基酸被替换成VHH中的氨基酸的方法不等同于骆驼自然形成的VHH。这说明生物体通过众多可能的组合中选择出了有功能的VHH。虽然V-NAR和VHH的序列很多样，但是在VL中极性和带电氨基酸证实了抗原结合区域进化的不同。
VH与VHH第二个不同点在于HV的loops：因为骆驼中VHH识别抗原不需要VL，仅需要三个loop而不是常规抗体的6个loop。VHH中的loop更长以形成充分与抗原结合的600-800埃的表面。这一点通过氨基酸序列比对就可以清晰的看出H1loop中HV区和H3loop的延伸（图2）。增大的HV loop1基因可以在胚系基因中找到，但是增长的H3 loop可能是功能性VHH经V-D-J重组后选择而来的。增大的loop意味着更大的灵活性，在结合抗原时会造成熵反作用。在骆驼的VHHs中通过脱盐键约束了增长的loop，进而减少了熵值。实际上，许多骆驼的VHH H1和H3 loop中有增多的可以形成脱盐键的半胱氨酸（图2），从而可以在没有结合抗原时限制loop的灵活性。而美洲驼的VHH中额外增多的脱盐键存在的频率小，但是H3 loop的平均长度小于单峰骆驼的VHH。单峰骆驼中的脱盐键主要分布在H1和H3 loop中，但是也有一小部分约10%的VHHs的脱盐键也出现在H3和FR2之间第50的位置处。鲨鱼中的V-NARs也进化出相当数量的脱盐键将结合抗原的loops栓在一起。美洲驼和一些单峰骆驼的VHHs在H2 loop和H3 loop中也有脱盐键。虽然H1 loop中的半胱氨酸限制在30，32，33（FR2中的50或H2中的55），H3 loop 中的半胱氨酸分布在H3 loopN端、中间、C端几乎所有可能的位置处。有些VHHs的H3 loop有向外延伸的结构，主要存在于在42位置处有酪氨酸或者H3 loop比一般的短的VHHs中。VHH中存在Phe42的情况下，H3 loop会形成一个拉伸扭曲转的特殊结构，环的底部是扭曲的，尖端向C’折叠。在这种构象中，Phe42被H3 loop隐藏而无法与水接触（图2）。Trp118（FR4），Tyr（FR3）以及Phe117或Tyr117可能起到稳定H3 loop的作用。
VHH扁长的结构形成凸出的结合部位，这种结构利于其插入抗原表面形成的腔。这种结合增加了抗体结合部位实际互作的表面。长的H3序列形成一个突出的loop；但是，也有例外，如许多Nb的结构形成扁平的表面。在V-NAR中，在D-E折叠处形成的HV4有可以结合抗原，但是VHH的HV4结合抗原的能力很有限。相反，H1 loop延伸出的N端参与了抗原识别。综上，抗体结合部位的结构可形成突出的或扁平的结构，而且可以看到形成的抗半抗原腔。
图2 Schematic representation of the H locus in the genome of camelids which consists of several variants of the IGHV1 IGHV4 IGHV3 andIGHV3H genes upstream; there
3重链抗体特有的基因
3.1 骆驼中H Locus的组装
人和鼠的H locus包含许多处于保守的免疫球蛋白基因IGHM IGHD IGHG IGHE和IGHA上游的V，D和JH元件，虽然单倍体中这些基因的拷贝数在不同动物中会有差异。骆驼中产生常规抗体和HCAb抗体的重链基因位于同一locus（图2）。单峰骆驼和羊驼的IGHG基因产生HCAbs。因此，一些IGHG基因是只有常规抗体产生中用到的，而HCAbs会用到不同的IGHG基因。与常规抗体的IGHG基因不同，这些基因产生完全相同用来产生分泌型的或膜结合的IgG分子的外显子，内含子，切换区域以及可替代性的多腺苷酸位点。CH1外显子的核酸序列是嵌入的；但是，这个区域在由于破环了CH1 N端的GT，G突变为A，因此被剪切。很可能这种剪切在骆驼中不需要特有的剪切因子，单峰骆驼的IGHG2a基因被VHH-D-J基因上游启动子替换为NSO小鼠xibao系或转基因小鼠是可以剪切CH1而产生在培养上清或血清中有功能的HCAbs。但是，将单峰骆驼IGHG2和IGHG3的CH1突变却不能产生有功能的HCAbs。HCAbs的产生可能需要CH1外显子全部切除。这一点可能说明CH1其他的氨基酸对于CH1的剪切起作用。分析单峰骆驼发现可能存在在HCAb形成中起作用的IGHG基因。
羊驼中可能只存在一种IGHM基因可以切除CH1。而且cDNA测序发现重排的VH-D-J和VHH-D-J区域包含CH1外显子序列。
3.2 VHH基因专有的 H locus
骆驼家族基因组也有VHH胚系基因（IGHVH）散布于常规抗体VH胚系基因中（IGHV）（图2）。IGHV和IGHVH基因由于分别编码显著不同的FR2而很好辨认。单峰骆驼基因组包含50IGHV基因和40IGHVH基因，但是羊驼含有71IGHV和17IGHVH基因。在B细胞形成中，IGHV或IGHVH基因参与V-D-J重排编码为VH或VHH。因为VHs和VHHs共用D和J基因，但是VHHs却形成更长的H3 loop，可能的解释是：（a）V-D-J重排时更强的脱氧核酸转移酶活性，但是这将意味着部分B细胞被区分以产生HCAbs；（b）B细胞受体被选择以确保V-D-J重排后形成特定的V结构；（c）含有较短H3 loop的VHH由于不能形成与抗原结合的更大的结合表面而被淘汰。有趣的是，IGHVH基因在CDR1的半胱氨酸密码子处或单峰骆驼（FR2 50）及羊驼Cys55不同于IGHV区。
H3 loop中第二个半胱氨酸密码子出现在V-D-J重排后或之后的体细胞超突变。显然的是，B细胞中V-D-J产物中只有一个Cys密码子将被淘汰如果这一Cys没有被取代或者没有形成第二个Cys密码子。如果只有一个Cys将会导致VHH二聚体的形成从而不能发挥其结合抗原的能力。
IGHVH基因在另一个细微处也不同于IGHV区基因。IGHVH基因中通常包含特殊的序列（如Ig 识别信号序列的回文序列、七倍体类序列），这些基因被认为倾向于形成不均等DNA重组，基因转换或基因替换序列。以此推测这些基因元件引导基因更快的进化以更快的扩增IGHVH。此外，这些元件可能也负责B细胞受体的编辑。对于识别特异抗原的VHH通过后续的噬菌体展示经cDNA测序后发现相同的H3 loop（有相同的V-D-J重排）但是H1和H2 loop是不同的，不能排除是认为PCR所造成。
VHH和VH的另一个惊奇而又细微的差异是H1 loop。人和鼠的VH H1 loop中保守的Ala25，Gly27，Phe28，Phe30和Met39被认为是I型经典loop的结构。VHH胚系基因组，H1 loop Phe28（TTT）和Phe30（TTC）被Tyr密码子（TAT和TAC）替换。TAY碱基被认为是体细胞突变的热点碱基，这些密码子在VHH亲和成熟时会经常突变。而且，这一突变是VH H1 loop向N端loop延伸的主要原因，VH的H1 loop结构与人VH的H1 loop通常不同。
3.3 多样的VH基因有助于VHH库的形成
常规抗体的两个结合抗原的结构域首先经V-（D-）-J基因重排后组合而成，因此可以利用有限的基因实现多种可能的抗原结合结构。令人惊奇的是HCAbs虽缺乏VH-VL组合的多样性但其结合抗原的多样性与常规抗体相当。摩洛哥和阿拉伯国的两种单峰骆驼在不同时间免疫同一抗原后形成的VHH结构库比未免疫时更受限制，这些VHH经不同的IGHVH基因和J基因但相同的D基因组装而成。此外，二者的VHH中由D元件形成的loop结构有相同的抗原结合表面。但是，J和V基因元件显然经历了体细胞超突变。这一发现强调了这些抗体形成过程中亲和力成熟的体细胞突变和选择有重要作用。
VH或VL的数目提供了可能的抗原结合多样性。几年前，所有的IGHVHs基因属于IGHV3家族，是人和小鼠中最丰富而广泛的家族，是功能性抗体形成所需要的。但是，近期发现羊驼中的胚系基因IGHV1和IGHV4基因被鉴定。这些基因被认为可以产生常规抗体的VH结构域。IGHV4也存在于单峰骆驼中，但是可以产生VH和VHH结构域。这些VHHFR3的疏水性弱。
同样的，IGHV3基因（FR2有疏水GLEW）也可以产生HCAbs。因此，GLEW结构域的IGHV3的骆驼可能也可经V-D-J重排后形成常规抗体或HCAb。实际上，HCAb库中已经分离了有GLEW结构域的类VH。一些类VH结构域缺乏由J基因编码的Typ118这一与VL互作的保守型氨基酸（图2）。但是，一些骆驼中D-J重排时发生核酸的插入或缺失，5’J基因处的Typ（TCG）可能被截断而变为AGG，CGG或GGG密码子。Typ有三分之二的概率被Arg替换，三分之一的概率被Gly替换，Arg替换在骆驼VHHs比较常见。无论VH或VHH胚系基因，Trp被替换为Arg无疑将阻止其与VL的结合。在人和鼠（或其他动物除了骆驼）中缺乏HCAb IGHG基因，这些有Arg118的VHs在B细胞形成中可能被淘汰而不能生存。
3.4 重链抗体的个体发育
HCAb IgM发生的阶段是另一个未知的领域。实际上，我们并只知道pre-B细胞IGHVH基因重排时IgM如何转变为IgG。我们推测目前最有可能的是，IGHVH-D-J基因重排后与轻链的代替者VpreB和λ5结合。通常情况下，pre-B细胞中经IGHVH-D-J重排后未折叠的CH1与BiP蛋白结合而限制在内质网中。Bip蛋白应该被轻链的代替者所取代（重排前λ5类似于CL，VpreB类似于VL）以将重链表达在细胞表面和pre-B细胞受体的信号传递。VpreB若不能与VH结合的话将因影响pre-B细胞受体的暴露和信号传递而使B细胞消失。阻止pre-B细胞表面受体的表达的细胞将正常脱落，骆驼中HCAbs可能为了拯救细胞脱落而发生IGHM基因转换为IGHG基因。这种推测源于以下发现：（a）IGHVH-D-J重排后的IGHM常被发现包含CH1外显子，（b）与IGHV-D-J IGHM相比，IGHVH-D-J只有很少的比例（少于5%），（c）与IGHM共表达后IGHVH体细胞超突变的缺失。
4 纳米抗体的生理性状
4.1纳米抗体的抗原结合特性
由骆驼家族产生的单域可变结构称为纳米抗体，免疫后经噬菌体筛选外周血淋巴细胞克隆V基因后很快可以得到纳米抗体。与抗原特异结合的HCAbs在免疫阶段经历亲和力成熟。HCAb包含一个仅由360bp的基因片段编码的VHH结构域，这一基因片段可以经PCR一步反应便可得到，约106转化子代表了50ml血中所有的VHH库。不能成功免疫的情况下，免疫VHH库可以被天生的，半合成的或合成的V库替代，但是这样的库需要足够大（约109单克隆库）以筛选到高亲和力的结合子。
抗原特异结合的纳米抗体可以通过以下途径筛选得到：免疫，噬菌体展示，细菌展示，酵母展示，细胞内杂交瘤筛选，核糖体展示等等。但是在众多筛选方法中，V库更倾向于在噬菌体表达并且在吸附有抗原的微板上淘洗，或者将抗原经biotin标记后固定在覆盖有链霉素的固相上。通常情况下，两到三轮的淘洗可以富集足够多的可用于经ELISA筛选的克隆。ELISA筛选后得到的阳性克隆经测序可推测纳米抗体的序列。多轮的抗原或少量蛋白免疫后经这以筛选流程共需不到两月的时间。这一方法可以被平行的用于其他结合子的筛选。因此，识别数百个抗原的纳米抗体可以被一个研发人员在一年内筛选而得到。
4.2 纳米抗体的亲和力参数
对于单链抗体的研究经VH和VL外显子经PCR扩增得到后迅速升温，PCR扩增和克隆使得从B细胞得到完整的VHH称为可能。因此，免疫库里得到的VHH质量好，具有抗原识别的专一性和较高的亲和力。Kon和Koff分别保持在105~106M-1s-1，10-2~10-4s-1，这样的亲和力常数对于多种应用是足够的。尽管如此，体外亲和力成熟的方法，如易错PCR，参入突变，核糖体展示及Ala突变以鉴定在抗原识别中起作用的关键氨基酸可以被用于提高或稳定抗原识别的能力。还有其他方法，如精心挑选的突变抗体结合表面的氨基酸进行突变，测定它们对抗原Nbs动力学和平衡亲和力的影响。这些数据结合多变量分析参数化量化并一个建立模型以定量预测算所有其他可能的关联参数在这些位置的突变体。
4.3 重组纳米抗体的表达
纳米抗体可以在微生物、哺乳动物和植物中获得高效表达。细菌表达中，纳米抗体连接信号肽可以将其带到周质中，周质中的氧化环境有利于形成脱盐键，纳米抗体通常连有6*His tag，经Ni柱亲和层析就可以得到纳米抗体。这样简单培养的方法可获得每升几毫克的纳米抗体。对于不能有任何tag的纳米抗体表达需用protein A来纯化。
4.4 纳米抗体的稳定性
纳米抗体可以通过超滤管浓缩到统一的磷酸或三磷酸酯缓冲液中保存。纳米抗体的保存期很长，在4度或零下20度保存都可以保持很好的抗原结合能力。在37度保存几周仍可以好的活性。纳米抗体在严苛条件下仍很稳定并且有一定的抗化学和抗热稳定性。纳米抗体通常在60-80度下变性。一些纳米抗体有很强的抗热稳定性，可以忍受90度以上的温度并且其化学稳定性为60 kJmol−1。在纳米抗体中引入Cys54和Cys78可以通过形成脱盐键而其稳定性。这样改造过的纳米抗体可以抵抗胃蛋白酶或糜蛋白酶的降解。通过DNA重组和选择可以筛选到抵抗胰蛋白酶的纳米抗体。此外，通过在极端条件下进行噬菌体展示可以筛选到抵抗极端条件的纳米抗体。耐高温高酸的噬菌体已被应用于筛选高耐受力或者在生理条件下具备可逆折叠能力的纳米抗体。
因为纳米抗体（VHH家族3）非常保守，因此可以将稳定性差的纳米抗体改造成稳定性强的抗体为骨架loop引入抗原识别loop的镶嵌型纳米抗体。但是一些纳米抗体的稳定性由与抗原直接接触的CDR3决定不能通过这种改造方法提高稳定性。
4.5 纳米抗体是非免疫原性的
纳米抗体分子量小，稳定性好，在血液中容易清除并且与人的VH序列高度相似都显示纳米抗体的低免疫原性。在人和鼠中注射纳米抗体都没有引起免疫原性。并且可以通过将14个氨基酸中12个氨基酸突变将骆驼的VHH人源化。
4.6 纳米抗体的抗原识别表位及多价或多特异性的结构
纳米抗体突出的抗原识别表面可以结合腔型的抗原，例如有活性的酶。因此，很多纳米抗体影响酶的活性。纳米抗体可以抑制或激活酶的活性。
纳米抗体由于是单体而且分子量小被认为是改造为多结构的构造的理想选择。一些二聚体的纳米抗体构造已经被鉴定：（a）双价的单特异性的纳米抗体增强了抗原的识别亲和力；（b）双价的识别同一抗原不同表位的纳米抗体增强了亲和力；（c）识别不同抗原的双特异性纳米抗体。此外，纳米抗体可以连接一些蛋白以形成二聚体或多聚体，如亮氨酸拉链结构域或verotoxin五聚体。纳米抗体可以与人的CH2和CH3，或鼠或猪的IgG连接后转染骨髓瘤细胞系中形成镶嵌的HCAbs。
5 纳米抗体的应用
实用的抗体具有以下特点：生产成本低、分子量小、人源化或人源序列、在含水的溶液中稳定性和溶解性好、折叠的可逆性好、抗原识别的特异性好、亲和力高等。通常在免疫库中筛选得到的纳米抗体可以不用体外改造就达到这样的要求。纳米抗体可以识别到常规抗体不识别的抗原。很显然，纳米抗体理想的性状激发了科研院所，生物医药公司研究纳米抗体的兴趣，从而可以研发出用于诊断或治疗疾病的纳米抗体。纳米抗体的应用已证实了理论研究的正确性，而且被广泛应用。接下来我们列举纳米抗体相比于其他抗体的优势。
5.1 纳米抗体可以作为研究工具
利用纳米抗体技术可以鉴定得到结合诊断胞内信号传导分子、肿瘤标记物或多种可用于诊断的纳米抗体。将纳米抗体与荧光蛋白抗体融合可以形成化学抗体或荧光抗体以追踪抗原的亚细胞定位。此外，GFP融合的纳米抗体结合有机染料可以获得高清晰的定位图片。利用纳米抗体可以追踪蛋白的表达，定位及亚细胞水平的定位。同时，细胞内表达的单域抗体可以与胞内抗原结合，这样的单域抗体可以与常规的原位杂交抗衡，进而检测难度较高的互作以及解决不可成药的问题。
除了可以阻断蛋白间的互作，纳米抗体还可以用于将抗原通过泛素途径降解抗原。Drosophila melanogaster and Danio rerio 的模型中将GFP标记的纳米抗体与F-box 结构域融合招募多泛素化机制从而降解与纳米抗体结合的靶蛋白。几年前，纳米抗体可以稳定蛋白促进其形成晶体以解析这些重要蛋白的三维结构。现在研究者利用单域亲和试剂来固定高度不稳定的区域或者通过去污剂将膜蛋白的疏水抗原结合表面隐藏从而的到更好的成晶条件。纳米抗体与抗原结合稳定抗原（如酶或受体）以得到抗原的三维结构。
5.2 纳米抗体可以作为诊断工具
纳米抗体应用到定量检测和捕获靶蛋白经历额很长的时间。分子量大的常规抗体可能更适合随机结合到固定的表面。但是，高亲和性的纳米抗体可以经简单的改造避免抗原结合表面周围反应性的化学基团（主要是赖氨酸的氨基）以及利用这些化学基团将纳米抗体作为敏感而特异的生物传感器。同时，纳米抗体可以连接金属颗粒用于激光治疗。将纳米抗体基因连接磁小体蛋白MamC在趋磁细菌Magnetospirillum gryphiswaldense 中可以通过磁性纳米颗粒直接得到纳米抗体。纳米抗体可以与固体，惰性或磁性物共价结合的特性可以被应用作为亲和力吸附剂。因此开发除了nanotrap-固相的纳米抗体可以以GFP或各种亚型的免疫球蛋白为靶标。这两种免疫吸附剂分别被ChromoTek GmbH (Planegg-Martinsried Germany) and BAC BV (Naarden Netherlands) 商业化。后者近期引进了结合tag的纳米抗体。这一纳米抗体特异性识别作为tag的Glu-Pro-Glu-Ala（EPEA）的C端。这将减少非特异性吸附。
纳米抗体一般小于50KD，在血液里很快被清除，这些是体内成像所需的理想试剂。放射性核素68Ga 18F的半衰期分别是68min和110min，被用于快速检测靶蛋白并且在血液中快速清除。这一方法应用了正电子发射断层扫描和计算机断层成像，是小分子浓度测量的实用方法，注射后1-3小时内可以追踪靶蛋白，病人的辐射负荷较小。在小鼠移植物中用68Ga标记识别HER-2和V-CAM1纳米抗体后三小时可以检测二者的含量。
5.3 纳米抗体可以作为治疗药物
抗体被用作被动免疫用于治疗中毒者或感染者。虽然多克隆抗体通常有更好的中和活性能起到更好的保护作用，单克隆纳米抗体可以有很高的识别抗原能力。此外，蝎子毒素和一些抗菌毒素以及抗蛇毒素的纳米抗体被深入研究。而且常规抗体会阻碍其对于病毒，细菌或寄生菌等病原物关键表位的识别，这种情况下，纳米抗体有更好的治疗优势。
一些其他由纳米抗体治疗衍生的方法还在进行中，如 anti-IL6R 和 anti-TNFa 治疗炎症， anti-von Whille brand factor 用于治疗血栓性血小板减少性紫癜以及一种 anti-RANKL 治疗骨丧失障碍等。但是，与其他治疗化合物的竞争很激烈。纳米抗体的优势在于用药的便利（局部，口服或吸入），以及通过连接部分白蛋白或通过改变水动力容积增加药效时间。
此外，亲和力成熟的纳米抗体可以区分结构相近的同源抗原；这种高特异性识别能力是大多数小的有机拮抗剂不能识别的。因此，纳米抗体被用于阻断一些酶的活性，如在淋巴器官中造成的ART2.2活性。
纳米抗体也可以用作将目标蛋白递送到难以接触到的靶器官中。这可以用于克服血脑障碍以及上皮细胞的胞吞转运。
参考文献
Serge Muyldermans. Nanobodies: Natural Single-Domain Antibodies. Annu. Rev. Biochem. 2013.82:775-797.
