细胞培养条件对蛋白质糖基化的影响（细胞培养条件对蛋白质糖基化的影响）

细胞培养条件对蛋白质糖基化的影响（细胞培养条件对蛋白质糖基化的影响）许多复杂的蛋白质，例如抗体和酶，都是糖蛋白，含有2–30％的碳水化合物。糖基化是一个复杂的过程，碳水化合物通过天冬酰胺（N-连接）或丝氨酸/苏氨酸（O-连接）氨基酸附着到蛋白质上。蛋白中可能含有多种糖类型，每种糖都有多个附着位点，生产中使用的哺乳动物细胞变异会导致细微的糖基化差异。为什么糖基化很重要？用于重组蛋白质生产的宿主细胞系的选择首先取决于蛋白质的分子特性。某些细菌可用于生产简单的蛋白质，即仅由氨基酸聚合物组成的蛋白质，没有诸如糖基化的翻译后修饰（Post-translational modification，PTM），因为大多数细菌菌均无法进行糖基化。使用简单的培养基即可快速进行生产；但是，在纯化工艺上可能具有挑战性。使用酵母可以快速产生具有原始糖基化的蛋白质。通常与杆状病毒载体一起以瞬时表达的方式，昆虫细胞主要用于研发和基本产品。哺乳动物细胞用于生产复杂的蛋白质，例如抗体和酶，需

本文主要讨论了细胞培养条件对生物制品质量的影响，重点介绍了糖基化及其准确评估所用的分析技术。糖基化可能会影响蛋白质的半衰期、免疫原性、结合活性和稳定性。蛋白糖基化是一个复杂的过程，包括碳水化合物部分的连接，以及可能通过蛋白质结构中的天冬酰胺（N-连接）或丝氨酸/苏氨酸（O-连接）氨基酸连接的位置。在哺乳动物细胞培养过程中，使用不同的细胞系培养可能会在可能发生的糖基化类型上产生重大差异。糖基化的这些差异可能会对所产生的治疗性蛋白质的质量产生重大影响，细胞克隆的选择、所用的基础培养基和补料培养基也会对糖基化产生影响。

蛋白质药物在生产中使用的宿主细胞的选择和生物反应器条件会显着影响蛋白质产品的质量。这既是由蛋白质本身结构的复杂性决定，也是由在细胞培养过程中可能发生的特异性翻译后修饰所决定的，其中糖基化对药物的质量特别重要。

蛋白质和细胞培养对蛋白质质量的影响

生物药物是具有聚合物结构的蛋白质，其结构是从氨基酸序列（称为一级结构）开始，通过将氨基酸链折叠成局部，二级结构和三级构象。多链蛋白，例如IgG抗体，还具有由亚基之间的结构产生的四级结构。

用于重组蛋白质生产的宿主细胞系的选择首先取决于蛋白质的分子特性。某些细菌可用于生产简单的蛋白质，即仅由氨基酸聚合物组成的蛋白质，没有诸如糖基化的翻译后修饰（Post-translational modification，PTM），因为大多数细菌菌均无法进行糖基化。使用简单的培养基即可快速进行生产；但是，在纯化工艺上可能具有挑战性。使用酵母可以快速产生具有原始糖基化的蛋白质。通常与杆状病毒载体一起以瞬时表达的方式，昆虫细胞主要用于研发和基本产品。哺乳动物细胞用于生产复杂的蛋白质，例如抗体和酶，需要完整的PTM，包括有些复杂的碳水化合物。

下图1中显示IgG抗体的结构，糖基化位点和潜在的变异性。与小分子药物相比，蛋白质是易碎分子，面临多重稳定性挑战。典型的糖蛋白（例如IgG抗体）在其结构内具有许多可变位点，包含了四条链，总分子量为150000 Da。另外，可能发生蛋白质链的几种翻译后修饰，例如特定氨基酸的氧化和脱酰胺。每条重链还可以发生糖基化位点。

图1：显示IgG抗体结构，糖基化位点和潜在变异性示意图。

为什么糖基化很重要？

许多复杂的蛋白质，例如抗体和酶，都是糖蛋白，含有2–30％的碳水化合物。糖基化是一个复杂的过程，碳水化合物通过天冬酰胺（N-连接）或丝氨酸/苏氨酸（O-连接）氨基酸附着到蛋白质上。蛋白中可能含有多种糖类型，每种糖都有多个附着位点，生产中使用的哺乳动物细胞变异会导致细微的糖基化差异。

细胞克隆的选择会影响产品质量。每个克隆的糖基化和PTM能力略有不同，并且活力各不相同，从而导致释放到培养基中的细胞内降解酶的差异。因此，可能有必要选择的细胞株不是最高表达量的细胞克隆，而是可以实现所需的蛋白质质量的细胞株。

细胞培养条件的影响

影响糖基化类型和程度的细胞培养参数包括pH、CO2含量、溶氧量（dO2）、温度、 营养素水平和种类、聚糖前体的存在和类型、细胞存活力，因为垂死的细胞释放降解酶、和工艺过程控制水平。

与摇瓶相比，生物反应器可提供对pH和溶解气体的更大控制，因此可实现更好的过程控制，但摇瓶更经济，可轻松使用更大数量或更大的规模。因此，摇瓶通常用于培养基和补料条件的早期筛选研究。通过与生物反应器合作，通过选择基础培养基和培养补料以及添加这些补料的时间来提高生长和生产力，从而实现最佳的细胞培养；还可以通过优化生物反应器的充氧条件，例如CO2水平、pH、搅拌、温度、接种密度和分配比；通过使用温度变化来延长细胞培养的生产阶段的活率；并最大程度地减少诸如氨等抑制生长的代谢物的积累。

最近，微型生物反应器的可用性提供了进行多参数研究的有效途径。因此，可以进行“实验设计”（DoE）研究的方法，在该方法中可以同时评估多个相互反应的生物反应器条件。此类研究要求使用自动化的大量生物反应器以使该过程可行。

生物仿制药的细胞培养注意事项

生物仿制药研发可以使用是蛋白质药物的“通用”版本，必须与原研药物高度相似才可以。监管指南要求与原研药物同时进行广泛的分析测试，包括完整的糖基化谱图。与原研药物的相似性至关重要。这必须从克隆选择开始，并贯穿整个研发过程。因此，不是优先选择滴度最高的克隆（如创新药物通常如此），而是首先选择生物相似性，这可能意味着未选择某些高表达的克隆。

糖基化分析技术

当碳水化合物以共有序列天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸连接到天冬酰胺上时，就会发生N-糖基化，其中X是脯氨酸以外的任何氨基酸。当表达的蛋白在细胞内质网中合成时，发生了预先形成的脂质固定保守聚糖的整体转移。当合成的蛋白质通过高尔基体进入时，保守的N-连接的glyan被酶（糖苷酶和糖基转移酶）“加工”。这些加工酶的存在，它们的相对水平以及蛋白质上糖基化位点对这些酶的可及性决定了蛋白质的最终糖基化类型。

O-糖基化发生在氨基酸丝氨酸和苏氨酸上，但不符合线性共有序列。有一些控制该过程的规则，例如，糖基化区域内经常有附近的脯氨酸氨基酸，而且丝氨酸和茶氨酸的串联重复也很常见。

N-聚糖

分析N-聚糖分析是最活跃的研究领域。适用于N-糖基化分析的技术也适用于O-糖基化。

哺乳动物中最丰富的N-聚糖结构是复杂类型，其中许多N-乙酰氨基葡糖结构被附加到分子上，并与半乳糖，岩藻糖和唾液酸残基一起延伸，形成两个至四个触角结构。确切的结构反映了表达过程中所用细胞类型中存在的酶的性质，以及细胞所处的精确环境。

国际协调会议（ICH）质量指南Q6B描述了应针对这些结构进行的分析类型，以了解存在的不同类型单糖的量，聚糖的触角分布特性和连接性每个结构中的单糖含量，以及蛋白质骨架上不同糖基化位点的聚糖结构。

详细信息的分析过程：

糖基化的分析涉及许多物理和酶促步骤，以释放聚糖，然后将它们与肽和混合物中存在的任何O-糖肽分开。O-聚糖可以从这些O-糖肽中化学释放，并与其余肽链分开纯化。

然后对分离的N-聚糖和O-聚糖进行全甲基化衍生，使它们可以使用基质辅助激光解吸电离质谱法（MALDI-MS）分析。

也可以使用色谱分析样品，而不必采用全甲基化方法。例如，带有脉冲安培检测（HPAEC-PAD）的高pH阴离子交换色谱法可用于分析N-聚糖。从牛胎球蛋白释放的N-聚糖中可以看到一个例子，如下图2所示。该方法在三种制剂中提供了一致的数据，代表了两个，三个和四个唾液酸化聚糖的一系列簇峰（即，每个簇中N-聚糖上的两个，三个和四个唾液酸基团）。该分析根据所产生的产物给出了一些结构信息，而对于聚糖的确切性质却给出的信息很少。因此，像这样的技术对于比较工作很有用，但没有提供太多表征分子的结构信息。

图2：高pH阴离子交换色谱分析，以及从三种牛胎蛋白制剂中释放的聚糖的脉冲安培检测（HPAEC-PAD）色谱图。

上图2为堆叠的高pH阴离子交换色谱法与脉冲安培检测（HPAEC-PAD）色谱图，也显示了三种牛胎球蛋白制剂中释放的聚糖的色谱图。在另一种方法中，可以使用荧光标签2-氨基苯甲酰胺-专门标记释放的N然后可以色谱分离这些标记的N-聚糖。然后通过质谱（MS）分析色谱洗脱液，以鉴定单个结构的质量。这是一种有用的技术，因为色谱图不仅提供了批次间的比较，而且还提供了每个峰中聚糖质量的信息。该技术非常敏感，因此有可能解析和识别所谓的G1F结构的两种不同形式，抗体上发现的单半乳糖基化双触角聚糖。两种成分在双天线结构的任一臂上均具有半乳糖结构，可以将它们分开。但是，必须进一步使用质谱分析才能完全表征这些聚糖的成分。

使用质谱表征

前述的过甲基化方法允许在非衍生化状态下分离具有相似质量的聚糖。例如，两种聚糖-具有相同的结构，除了一个包含一个N-乙酰神经氨酸（唾液酸）残基，另一个包含两个岩藻糖残基-在天然状态下，分子量仅相差1Da，但当相差13Da时，具有相同的结构衍生化。基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）分析可得出存在的聚糖的总体概况。使用光谱分析的峰（质量），结合对N-聚糖，核心结构和存在的生物合成途径的了解，可以得出聚糖单糖的组成。

接下来，可以使用电喷雾质谱（ES-MS）裂解过甲基化的聚糖。这种分裂作用是有用的，因为断裂路径是明确定义的，并很好理解，根据断裂发生的位置产生特定的质量。该过程取决于N-聚糖结构的确切性质，因此这些片段的质量允许确定存在于聚糖上的触角结构。

也可以使用第三种方法，即气相色谱-质谱（GC-MS），以确定单糖如何在聚糖结构内相互连接。这些结构变化会对药物的功效和性质产生很大影响。

通过化学修饰过甲基化的聚糖，并在每个单糖相互连接的地方附加特定的“报告基团”，可制得衍生物，当通过质谱分析时可提供关键的结构信息。使用电子冲击质谱仪，碎片图谱显示了不同键的特征指纹。此外，质谱仪前端的GC装置可以识别具有不同报告基团的每个不同的链接结构，因为它们从GC色谱柱上洗脱的时间不同。GC保留时间和质谱指纹图谱碎片图谱的组合可确定聚糖群体中的不同单糖键。

表征的最后一步是确定结构中任何连接的立体特异性，其中数据表明可能存在潜在的免疫原性表位，例如GalαGal（已知的免疫原性表位）。用特定的糖苷外切酶处理聚糖并通过MS暴露前和暴露后进行分析可以通过显示孵育后的质量转移来确认存在α-连接的半乳糖。

结论

蛋白质与小分子药物相比，本质上是复杂的，并且其大小要大得多，而大多数PTM包括糖基化在内都是多种蛋白质疗法的特征。它们的出现取决于蛋白质的分子性质。细胞类型和单个克隆的选择；以及细胞培养和生物反应器条件。需要广泛的分析测定来表征蛋白质治疗剂。生物仿制药比创新药物需要更多的分析测试，因为需要证明与给定创新分子的生物相似性。

质谱分析可提供有关N-聚糖分子中存在的组成，结构和键的结构信息，并且由于聚糖的精确结构和相关联的相互作用，色谱法的使用可提供独特的聚糖谱。此配置文件可用作参考，可以与其他批次进行比较。此外，使用LC/ES-MS进行蛋白水解酶切可以分离和鉴定糖基化位点。然后可以使用多种技术来分析这些位点，以确定每个位点上的聚糖的性质以及生物药物分子上聚糖的特定群体。

文章来源：

1. D. Ghaderi et al. Biotech Gen. Eng. Rev. 28 pp. 147–176 (2012).

2. S.D. Jones et al. Am. Pharma. Rev. 18 (1) pp. 44–48 (2015).

3. FDA Guidance for Industry Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product (Rockville MD Apr. 2015).

4. FDA Guidance for Industry Quality Considerations in Demonstrating Biosimilarity of a Therapeutic Protein to a Reference Product (Rockville MD Apr. 2015).