有机含氟基团溶解性（ACSCatalysisP450）
有机含氟基团溶解性（ACSCatalysisP450）由于α-羟基化产物5是一种转瞬即逝的手性中间体并且难以直接检测，作者转向计算研究以获取有关产物5到4自发转化的一些线索（图 1a）。由于缺乏关于中间体5绝对构型的信息，作者使用 Gaussian 16分别对 (S)-5(S-RC1) 和 (R)-5(R-RC1)进行混合簇连续 (HCC) 模型计算。图3显示了从中间体5到中间体4的脱氟过程计算的相对自由能曲线。对于(S)-5，自由能垒仅为11.8 kcal/mol；在 (R)-5 的反应中发生了类似的过程，自由能垒为11.0 kcal/mol 。两个能垒都非常低，表明在这些反应中从5到4的转化是快速和自发的。为了更好地分别揭示具体的反应过程，作者首先尝试构建增强化学选择性的突变体。由于已报道变体 F87A 可增加 2-苯乙酸酯的 α-羟基化活性，因此测试了其对底物1的活性，结果反应体系中仅检测到产物2。为了进一步研究产物2的生成过程，通过G
今天推送的文章发表在ACS Catalysis的“Discovery of a P450-Catalyzed Oxidative Defluorination Mechanism toward Chiral Organofluorines: Uncovering a Hidden Pathway”，通讯作者为通讯作者为湖南师范大学化学化工学院化学生物学与中药研究教育部重点实验室、湖南省植物化学研究与开发重点实验室的王健博教授。
由于氟取代化合物所具有的独特的化学和物理性质，有机氟已广泛应用于药物、农用化学品、材料和用于能量转换的化合物中。然而，由于强碳氟 (CF) 键 (130 kcal/mol)，有机氟的降解非常具有挑战性。自然界中有机氟，特别是全氟和多氟烷基化合物（PFCs）的泛滥和积累，对生态环境和人类健康构成了严重威胁。为了实现有机氟的降解，已经开发了多种方法，包括化学降解和生物降解。研究发现 P450s 能够催化某些氟烷烃、氟芳烃甚至含氟大分子药物的氧化脱氟。
目前已有由 P450 催化的各种氧化脱氟程序的报道，但机理研究主要集中在氟化芳族化合物的脱氟上。P450 催化的氟化芳烃氧化脱氟涉及 FeIV=O (Cpd I) 对底物的亲电攻击，瞬态阳离子中间体的形成和重排，以及作为最终 Fe-O 键断裂的醌和氟离子释放的产生（方案 1a）。在还原剂的存在下，醌可以进一步还原为酚类产物，例如对苯二酚。在这个经典模型中，P450催化的氧化脱氟都发生在非手性中心，未见在手性中心发生氧化脱氟的报道。已知此类化合物具有特殊的化学和物理特性。因此，揭示这种情况下特定的 P450 催化的脱氟过程对于了解基于有机氟的治疗药物的体内代谢和自然界中含氟污染物的降解是必要的。
在本研究中，作者报告了P450-BM3启用的两种不同的氧化脱氟路线（方案1b）。除了涉及α位羟基化诱导的脱氟的正常脱氟途径外，还发现了一种不寻常的脱氟途径，即发生在苯环的远程羟基化。另外发现 P450-BM3 在导致的远程芳烃羟基化脱氟过程中对R型底物表现出高立体选择性。
P450-BM3对底物1的脱氟反应
之前的研究证明α-氟苯乙酸是研究氟乙酸脱卤酶催化机制良好的底物。据报道， P450-BM3催化它缺氟的类似物苯基乙酸乙酯发生α位点羟基化，并具有高对映选择性。在前人研究的基础上，选择α-氟代苯乙酸酯作为探针研究P450-BM3催化的手性有机氟氧化脱氟反应。由于手性氟中心位于α位，反应的对映选择性可能不同。图 1a展示了可能的α 位羟基化过程。为了研究这种有趣的化学反应，作者测试了含有 P450-BM3 的全细胞对底物 1 的反应性。GC 分析检测到两种产物（图 1b），表明P450-BM3能够催化1进行脱氟。使用纯化的 P450-BM3 也得到相同的结果（图 1b）。GC-MS分析证明这两种产品分别是扁桃酸乙酯（(R)-2；ee >91%）和 2-（2-羟基苯基）乙酸乙酯（产物3）。这与常见的氧化脱氟路线不符，表明存在一种新的机制。动力学数据（kcat= 3.43±0.53 s-1，Km= 11.17±4.53 mM，TOF = 160 min-1，和 TTN = 909）和耦合效率（30.1%）说明P450-BM3 对模型反应具有适度的催化活性。
探索具体反应过程
为了更好地分别揭示具体的反应过程，作者首先尝试构建增强化学选择性的突变体。由于已报道变体 F87A 可增加 2-苯乙酸酯的 α-羟基化活性，因此测试了其对底物1的活性，结果反应体系中仅检测到产物2。为了进一步研究产物2的生成过程，通过GC在时间尺度上监测纯化的F87A 催化反应。如图 2a 所示，脱氟步骤非常快，反应一开始就形成中间体4。0.5 h后，4迅速积累并开始形成产物2。随着反应时间的延长，4逐渐减少，2逐渐增加。结果说明1的直接脱氟产物是 2-氧代-2-苯基乙酸乙酯 (4)，然后经过额外的还原步骤生成 2。葡萄糖脱氢酶 (GDH) 是最有可能参与还原步骤的还原酶。据报道它可以催化C=O和C=N键的还原。为了证明这一假设，用纯化的GDH对4的进行测试。结果表明，4被具有高R选择性（ee > 88%）的GDH完全还原为2（图 2b）。
由于α-羟基化产物5是一种转瞬即逝的手性中间体并且难以直接检测，作者转向计算研究以获取有关产物5到4自发转化的一些线索（图 1a）。由于缺乏关于中间体5绝对构型的信息，作者使用 Gaussian 16分别对 (S)-5(S-RC1) 和 (R)-5(R-RC1)进行混合簇连续 (HCC) 模型计算。图3显示了从中间体5到中间体4的脱氟过程计算的相对自由能曲线。对于(S)-5，自由能垒仅为11.8 kcal/mol；在 (R)-5 的反应中发生了类似的过程，自由能垒为11.0 kcal/mol 。两个能垒都非常低，表明在这些反应中从5到4的转化是快速和自发的。
为了构建仅产生产物3的突变体，应用了基于半合理饱和诱变的定向进化，在20个不同残基上进行 NNK单密码子饱和诱变文库的构建和筛选。但没有观察到具有改进催化特性的突变体，这可能是由于体外实验缺乏对不稳定的去饱和中间体7具有高活性的特殊还原酶，因此，无法筛选产生产物3（方案1b）所需的优良突变体。P450催化的苄基环羟基化似乎在脱氟中起关键作用。根据3的结构，推测反应过程同样涉及P450催化的羟基化和额外的还原步骤。如图4a所示，P450-BM3首先催化苯环邻位羟基化生成6，然后远程邻位羟基诱导C-F键断裂，形成中间体7。最后，类似于5的情况，7可能会被GDH样还原酶进一步还原为3。
因为6和7的稳定性差，无法在WT型 P450-BM3 催化1的过程中捕获中间体 6和7。因此选择结构与底物 1 相似的苯基乙酸乙酯来间接揭示1→6的过程。作者推测，如果P450-BM3能够催化1的芳香羟基化并产生6，那么苯乙酸乙酯应该与P450-BM3进行催化生成对应产物。结果在该反应中，以高S选择性生成扁桃酸乙酯 (2)，并且很容易检测到稳定的芳香族羟基化产物3。这表明在P450-BM3 催化1的反应模型中可能会产生中间体6。作者合成了6的O-甲基化类似物以通过去甲基化和通过用AlCl3和乙硫醇处理的亲核反应模拟脱氟过程来说明自发脱氟过程6→7（图4b）。作者推测，如果8在去甲基化后可以自发生成7，那么7应该很容易受到乙硫醇的亲核攻击以生成稳定的产物 9。实验结果通过 NMR光谱证实了9的产生。
由于中间体6和7a不稳定且商业上无法获得，作者采用同位素掺入实验来阐明还原步骤（图 4c）。当使用基于D2O的缓冲液时，观察到19%的氘掺入，但当使用d-葡萄糖原位生成 NADPD时，氘掺入高达67%，且氘掺入均发生在α位点。这些结果表明NADPH作为主要的氢原子供体使C=C的还原成为可能。
与全细胞系统相比，纯化的GDH催化形成3的产量较低，可能细胞内的另一种还原酶也可以催化这种还原。因此将全细胞或不含GDH的大肠杆菌裂解物与纯化的P450-BM3 混合并用于转化1，结果确实生成了3。由于具有烯还原(ene-reduction)活性，NemA是最有可能负责产生3的还原酶。因此使用纯化的NemA和P450-BM3 测试在脱氟反应中的反应性，结果检测到产物3，但没有发现2。总体反应性仍然很低，推测细胞中可能有两种以上的酶参与还原步骤。为了进一步支持假设，作者进行了QM计算以研究转换过程 6→7。图5显示了计算出的脱氟过程的相对自由能曲线，自由能垒高达20.2 kcal/mol，这与实验数据非常吻合。
MD 模拟揭示P450-BM3的立体选择性
根据观察到的底物消耗，P450-BM3表现出对R型底物的偏好。然而，由于2-氟-2-苯基乙酸乙酯在水溶液中容易水解，因此很难验证P450-BM3对(S)-1的活性。为了明确阐明该反应的立体选择性，分别研究了P450-BM3对 (R)-1和 (S)-1的脱氟反应。(R)-1和(S)-1分别通过氟乙酸脱卤酶和P450-BM3的手性拆分制备，然后进行测试。(R)-1和 (S)-1的均可被P450-BM3催化生成2，但活性较低，在远程诱导芳烃羟基化脱氟路径中，P450-BM3对(R)-1有明显的催化活性，而对(S)-1则无催化活性。P450 催化氧化脱氟的立体选择性也通过 MD 模拟得到证实。如图 S20 所示，残基 Phe87、Thr260 和 Ala264位于底物(R)-1和 (S)-1的周围，这将底物保持在所示的方向。作者首先研究了为何P450-BM3对α位羟基化无明显选择性。
在(R)-1和 (S)-1中，目标H原子和铁氧O原子之间的距离 (D1)分别为3.07 和2.47 Å。在(R)-1和 (S)-1的整个MD模拟期间，D1值约为3 Å，这有利于Cpd I 的吸氢反应。因此 (R)-1和 (S)-1都会发生α-羟基化。其次，对于芳香族羟基化，反应开始于铁氧代中间体 (Cpd I)的O原子对底物苯环中的目标C原子的攻击。在(R)-1和 (S)-1中，目标 C 原子和铁氧 O 原子之间的距离 (D2) 分别为 3.34 和 3.66 Å，很接近，但有两个因素导致了立体选择性：（1）目标 C 原子的 pπ 轨道的取向和（2）由(R)-1和 (S)-1在酶口袋的不同位置引起的空间位阻。对于 (R)-1 如图 S20a 所示，铁氧轴垂直于苯平面，使O原子的轨道与目标C 原子的 pπ 轨道有很大的重叠，这有利于CO键的形成。此外，O原子可以直接攻击目标C原子而没有任何空间位阻。对于 (S)-1，如图 S20b 所示，铁氧轴平行于苯平面，导致轨道重叠小得多，从而阻碍了 CO 键的形成。与目标C原子键合的H原子在O原子对C原子的攻击过程中进一步发挥空间位阻，使 (S)-1 的芳族羟基化更加困难。
整理：梁子琦
文章链接：
https://doi.org/10.1021/acscatal.1c05510
