目前实验室常用的植物rna提取方法（植物miRNA研究-文章5）

目前实验室常用的植物rna提取方法（植物miRNA研究-文章5）我们使用 EvaGreen 和 sRNA 特异性引物（Kramer，2011；补充表 1）进行了 qRT-PCR 。qRT-PCR 对每个样品进行了三个技术重复，每个反应包含相当于 20 ng/μl 初始 RNA 的 cDNA 量。qRT-PCR 程序在 95°C 下进行初始变性 2 min，然后进行 40 个循环的扩增，95°C 12 s，退火 30 s，72°C 15 s。每个循环后，测量 EvaGreen 信号并监测熔解曲线以确认引物特异性。ΔΔCt 方法用于计算针对UBI1看家基因标准化后的表达水平（Habermann 等，2020；Tiwari 等，2020）。psRNATarget：植物小 RNA 目标分析服务器（2017 年更新）用于识别推定的 miRNA 目标（Dai 等人，2018 年）。DE miRNAs 被用作查询拟南芥Araport11 转录本数据库，使用 UPE

Identification of Small RNAs During High Light Acclimation inArabidopsis thaliana（拟南芥强光驯化过程中小 RNA 的鉴定）

※翻译为google直译，并不严谨

材料和方法植物材料和胁迫处理

种子拟南芥哥伦比亚生态型（Col-0中（NASC;英国）），来自拟南芥诺丁汉保藏中心购买的，在土壤基板上的高密度（大约在9×9厘米盆50个种子）播种和分层4°C 避光放置 2 天。分层后将盆转移到光（LED-41 HIL2 柜，Percival，Perry，美国）中，并在控制条件下用 16 小时光（80 μmol 光子 m –2 s –1; 对应于 18% 的蓝色和红色通道）在 22°C 下，然后在 18°C 下黑暗 8 小时，持续 14 天。用作对照的植物保持在这些条件下，而经过强光处理的植物在 22°C 光照 4 小时后转移，光强度为 450 μmol 光子 m –2 s –1。之前的一项研究报告称，暴露于 450 μmol 光子 m –2 s –1 的植物表现出增强的光抑制。发现这些变化在去驯化阶段是完全可逆的，使这种光强度最适合研究高光驯化相关的变化（Garcia-Molina 等人，2020 年））。我们使用了对照样品和高光处理样品的三个生物学重复，并在 3、6 和 48 小时后收获了它们的地上组织。同时处理所有对照和它们各自的高光处理样品。在具有相同设置的同一室中进行了三个后续生物重复的高光处理。

RNA 分离和测序

1. 在 3 小时、6 小时和 2 天时间点后获得的未处理对照样品的 mRNA 和 sRNA 测序数据已在我们之前的研究中发表（Tiwari 等，2020）。
2. 之前已经报道了在 3 小时和 2 天后获得的高光处理生物三次重复的 mRNA 测序数据（Garcia-Molina 等，2020）。
3. 3 小时、6 小时和 2 天时间点后用于 sRNA 测序的样品一起处理。
4. 按照制造商的方案，使用TRI-Reagent (Sigma) 分离总RNA。
5. 根据我们之前的研究 ( Tiwari et al. 2020)进行文库制备和测序）。
6. 简而言之，mRNA/lncRNA 文库是使用 Next Ultra RNA 文库制备试剂盒 (NEB) 制备的，并在 Illumina HiSeq-2500 平台上对每个文库至少 1500 万个读取对的 150 bp 配对末端进行链特异性测序。
7. 使用 Illumina 的 NEBNext Multiplex sRNA Library Prep Kit (NEB) 按照制造商的说明从 50 μg 总 RNA 制备 sRNA 文库。sRNA 文库在 Illumina HiSeq 1500 上测序为 50 bp 读长，每个文库至少有 700 万个读长。

转录组的生物信息学分析

对 3 小时、6 小时和 2 天的高光驯化样品及其各自的对照进行测序，并使用基于开放网络的平台 GALAXY 1（Afgan 等人，2016 年）分析 mRNA/lncRNA 测序数据。使用默认参数通过 FASTQ Trimmomatic 工具修剪接头序列。Tophat 工具将原始读数与拟南芥TAIR10 参考基因组2进行映射，最大内含子长度参数为 3 000 nt。编码和非编码 RNA 转录本（≥200 bp）的注释使用 Araport11 注释（Cheng et al. 2017）。FeatureCounts 工具计算映射到参考基因组的读数数量。最终的基因列表是通过 GALAXY 的 DeSeq2 工具使用 FeatureCounts 工具的输出获得的，并使用 Araport11 参考注释3 进行分类。

TAIR10 参考基因组用于使用 Shortstack 软件 ( Axtell 2013 )绘制 sRNA 原始读数。大约 80% 的获得的读取有效地映射到参考。参考注释数据库是从可公开获得的来源，例如miRNA的（miRBase数据库版本22.1），lncRNA（Araport11），创建的反式-和顺式NAT-siRNA的，TA-siRNA和phasiRNA（。Howell等人，2007 ; Jin等. 2008 ; Zhang et al. 2012 ; Yuan et al. 2015）。使用这些来源，计算了不同类别 sRNA 的读取计数。随后通过 DeSeq2 工具分析了三份样品的读数计数，并鉴定了 FC ≥ 2 和 ≤ -2（Benjamini-Hochberg 校正的p值≤ 0.05）的差异表达 (DE) sRNA 。

预测假定的 miRNA 目标

psRNATarget：植物小 RNA 目标分析服务器（2017 年更新）用于识别推定的 miRNA 目标（Dai 等人，2018 年）。DE miRNAs 被用作查询拟南芥Araport11 转录本数据库，使用 UPE (25) 和最大期望 (2.5) 变化的默认参数，以确保更严格的预测。

假定 miRNA 靶标的基因本体分析

我们使用 DAVID 生物信息学工具（Jiao 等人，2012 年）进行 GO 分析。提供miRNA靶基因列表作为输入，输出基因列表大致分为生物过程、细胞区室和分子功能。在所有上述类别中都确定了重要的 GO 项（Fisher 检验，Benjamini-Hochberg 校正p值≤ 0.05）。ggplot2 包4用于输出的可视化。

Stem Loop qRT-PCR 的 cDNA 合成

我们使用来自处理和未处理样品的三个生物学重复的 300 ng RNA 作为 cDNA 合成的起始材料。将 DNAse I (2 U NEB) 添加到 RNA 中并在 37°C 下孵育 30 分钟以消除基因组 DNA 污染，然后在 65°C 下灭活 10 分钟。使用 M-MuLV 逆转录酶（200 U，NEB）在 42°C 下将 RNA 逆转录为 cDNA 30 分钟。对 sRNA 特异的茎环引物和通用反向引物用于 cDNA 合成（补充表 1）。我们在逆转录过程中使用了UBI1 ( AT4G36800 ) 特异性反向引物，并通过使用UBI1特异性基因引物通过 RT-PCR 确认了成功的 cDNA 合成。

茎环 qRT-PCR

我们使用 EvaGreen 和 sRNA 特异性引物（Kramer，2011；补充表 1）进行了 qRT-PCR 。qRT-PCR 对每个样品进行了三个技术重复，每个反应包含相当于 20 ng/μl 初始 RNA 的 cDNA 量。qRT-PCR 程序在 95°C 下进行初始变性 2 min，然后进行 40 个循环的扩增，95°C 12 s，退火 30 s，72°C 15 s。每个循环后，测量 EvaGreen 信号并监测熔解曲线以确认引物特异性。ΔΔCt 方法用于计算针对UBI1看家基因标准化后的表达水平（Habermann 等，2020；Tiwari 等，2020）。