迈瑞成长史深度解析（迈百瑞技术讲堂-工艺表征上游篇）

迈瑞成长史深度解析（迈百瑞技术讲堂-工艺表征上游篇）通过分析生产规模的Scale down 模型同样适合于N-1级种子培养，因此采用Scale down 模型对N-1级种子进行研究。结果显示接种密度和培养温度对N-1级第3天细胞密度有显著影响；不同实验条件下细胞活率均保持较高水平，无显著影响。细胞经过复苏，在一系列摇瓶、种子反应器中进行扩种，通常需要12-16天时间获得足够的细胞种子用来接种生产反应器。早期工艺开发阶段如果参数（比如摇床中CO2浓度）范围比较窄，也可以在该阶段补充研究，设定合理范围。常规的上游生产的流加培养工艺流程主要分为3个主要的步骤，即种子的扩增、反应器生产和澄清过滤。种子的扩增是为反应器生产提供足够数量的细胞；反应器生产是目的蛋白生产的环节；澄清过滤是细胞和上清分离的过程，获得的收获液用于下游纯化工序。2.第一次风险评估3.实验过程

哺乳动物细胞作为抗体、融合蛋白等药物生产的载体，承担着将氨基酸、葡萄糖等底物转换成蛋白质的角色，是药物生产中重要的工具。CHO细胞是应用最为广泛的宿主细胞，通过基因工程的手段将目的基因导入CHO细胞基因组，筛选获得高表达、稳定的工程细胞株。细胞株生长环境的变化会对细胞的生长、代谢产生影响，进而影响目的产品的产量和质量。因此上游细胞培养是工艺开发、工艺表征及工艺验证阶段研究的重点。

行业领先的一站式CDMO烟台迈百瑞国际生物医药股份有限公司已完成了数个项目的工艺表征、工艺验证工作。为推动行业进步，我们邀请迈百瑞团队对工艺表征及工艺验证工作的流程和思路进行分享，本期带来的是上游工艺表征的内容。

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1.上游生产基本流程

常规的上游生产的流加培养工艺流程主要分为3个主要的步骤，即种子的扩增、反应器生产和澄清过滤。种子的扩增是为反应器生产提供足够数量的细胞；反应器生产是目的蛋白生产的环节；澄清过滤是细胞和上清分离的过程，获得的收获液用于下游纯化工序。

2.第一次风险评估

• 细胞复苏及种子扩增（N-1级之前）阶段主要是培养足够数量高活率的细胞用于后续扩种，此时产品累积量低，对最终产品质量产生影响的风险低。通常为保证扩种流程的顺利进行，减少生产中可能出现的偏差，针对具体项目需要对扩种环节的工艺参数结合设备的控制能力进行评估，设定合理的参数范围。通过风险分析结合类似产品的生产经验，N-1级种子可能会影响产品的质量。
• N-1级种子扩增、反应器生产和澄清过是上游工艺表征的重点。采用FMEA 模型对工艺参数从严重性（S）、发生概率（O）、可探测性（D）三个维度进行评估，以三个维度的乘积RPN作为依据筛选可能影响 CQA 的工艺参数（pCPP），并制定pCPP的研究策略及检测策略。

3.实验过程

• 种子扩增

细胞经过复苏，在一系列摇瓶、种子反应器中进行扩种，通常需要12-16天时间获得足够的细胞种子用来接种生产反应器。早期工艺开发阶段如果参数（比如摇床中CO2浓度）范围比较窄，也可以在该阶段补充研究，设定合理范围。

通过分析生产规模的Scale down 模型同样适合于N-1级种子培养，因此采用Scale down 模型对N-1级种子进行研究。结果显示接种密度和培养温度对N-1级第3天细胞密度有显著影响；不同实验条件下细胞活率均保持较高水平，无显著影响。

采用Scale down 模型培养N-1级种子，分别用不同培养时间的种子接种生产反应器，显示N-1级细的胞密度随着培养时间的延长而升高，接种流加培养后细胞生长代谢、蛋白表达量和产品质量均无显著差异。

4.上游缩小模型的建立

目前主流的几种生产规模反应器在几何设计、搅拌方式和通气模式上存在较大差异，这使得细胞培养工艺的缩小模型建立充满挑战。

在上游缩小模型的建立中通常将工艺参数分为体积依赖性参数和非体积依赖性参数。体积依赖性参数，比如搅拌速度和通气量，需要通过一定的规则结合操作经验进行设计；体积非依赖性参数，比如温度和pH等通常保持不变。台式反应器或Ambr250通常用来作为Scale down 模型。利用2-5L规模的台式反应器在进行DOE研究时，运行成本较高、操作复杂，越来越多的上游工艺表征研究采用高通量的Ambr250反应器。

通过将缩小规模数据与商业化生产规模（如商业化生产规模批次有限可以包括中试规模）数据进行系统的对比，对缩小模型的代表性进行确认。上游缩小模型的确认策略主要有：1）生长代谢曲线的对比，2）工艺性能参数与关键质量属性的等价性分析。常规的统计学方法有TOST（two-one-sided t-test）、主成分分析和多变量分析（Multi-Variable Data Analysis MVDA）等。

5.反应器生产

通过科学的风险评估方法获得反应器生产阶段的 pCPP 后，通常采用DOE或 OFAT 对pCPP研究工艺参数对CQA的影响。

工艺表征中常用的DOE工具有部分析因设计（Fractional Factorial Design）、完全析因设计（Full Factorial Design）、Plackett-Burman设计、响应曲面设计（Response Surface Design）和确定性筛选设计（Definitive Screening Design）等。研究中需要根据对工艺的理解、实验次数、实验时间以及对分辨率的要求等因素合理选择 DOE 工具。

• DOE实验举例

通过DOE实验可以分析出对工艺性能和质量属性有显著效应的因子，比如温度2和流加比例两个参数对表达量的影响是显著的，随着温度2和流加比例对表达量是正向作用；流加比例对电荷异构体中的主峰有显著影响，随着流加比例的升高，主峰比例呈下降趋势。通过分辨率较高的DOE工具可以进一步分析因子的高阶相互作用，并可以将响应与因子的关系用回归方程呈现出来。

综合下游工艺对产品质量的影响（如聚集体的去除和酸性峰的比例的降低）和产品质量标准制定上游工艺质量属性的可接受范围，采用Monte Carlo模拟的方式确定参数的设计空间。

• OFAT实验举例

反应器生产中的培养时间对细胞活率、表达量及产品质量通常会有显著影响。研究发现随着培养时间的延长，细胞活率逐渐下降、表达量逐渐升高、电荷异构体中的酸性组分比例升高，同时HCP和宿主DNA的浓度升高。综合培养时间对产量和产品质量的影响，确定其可接受范围。

6.澄清过滤

商业化反应器的澄清工艺通常有两种方式：1）碟片离心机 深层过滤膜包，2）两级深层膜包。在第一种方式中通过离心去除细胞及大部分的细胞碎片，再经过一级孔径较小的深层膜包，去除剩余细胞碎片。在第二种方式中，细胞液依次经过两级深层过滤膜包，实现固液的分离。澄清过滤中离心力大小、流速和压力等参数会影响细胞的破碎程度，进而影响收获液中HCP和宿主DNA的浓度。同时，随着细胞破碎程度的升高，收获液中还原酶的浓度升高，此时抗体链间的二硫键可能断裂，自由巯基的水平升高，影响收获液及产品的稳定性。然而无论哪种澄清过滤的方式，都很难用DOE或单因素实验进行研究，此时通常需要综合小试、中试和商业化规模生产数据，选择Worst case方法进行研究，确定工艺参数的可接受范围。

7.第二轮风险评估

根据工艺表征研究结果进行第二轮风险评估，评估各操作单元/工艺参数对CQA或工艺性能的影响，筛选出CPP和KPP并确定其控制范围，为后续工艺性能确认批次提供控制策略。

关于迈百瑞

烟台迈百瑞国际生物医药股份有限公司，可为客户提供抗体、ADC 等大分子药物从细胞株构建到商业化生产的一站式 CDMO 服务。2021年底迈百瑞技术团队启动了第1个抗体项目的工艺表征，仅用5个月的时间就完成了该项目的工艺表征，目前该项目的工艺验证已完成，预计2023年初启动该项目的BLA 申报工作。第1个启动工艺表征的 ADC 项目已完成抗体及 ADC 工艺表征研究，预计今年第4季度启动工艺验证工作。第2、3个抗体项目的工艺表征工作正在开展第一轮风险评估中。

参考资料：

Hakemeyer C et al. Process characterization and Design Space definition Biologicals (2016) http://dx.doi.org/10.1016/j.biologicals.2016.06.004

CMC Biotech Working Group.A-MAb: a case study in bioprocess development. Emeryville CA: CASSS; 2009.