突变体蛋白结构分析软件介绍（IVD技术系列生物偶联设计思维）

突变体蛋白结构分析软件介绍（IVD技术系列生物偶联设计思维）确定某类偶联剂后，偶联剂结构或长度也是后续优化的一个方向，不同长度或分子量带来的电荷量或亲水性与疏水性也不一样，最终都将产生一定的蝴蝶效应。同时这些修饰也将影响偶联物的亲水性和疏水性，因为各组分最终连接的修饰物可能不止连接一个交联剂并这些交联剂会一直存在，最终影响偶联物整体的稳定性与非特异性。二、多种偶联剂的选择偶联剂的类型多种多样，如常用的同型多功能偶联剂戊二醛，异型多功能交联剂SMCC，两步法活化试剂NHS与EDC组合等。选择哪一种偶联剂首先取决各组分都有哪些可用基团，如常见的反应基团为-NH2和-COOH以及-CHO等。其次注意偶联物的溶解性，如用于免疫液相检测，则希望偶联物的溶解度要强一些，可用亲水性较强的基团如-OH修饰偶联剂如PEG链修饰或磺酸化修饰以提高水溶性；如用于原为杂交或免疫组化等需要穿过某些介质如细胞膜或核膜等，则可用疏水性较强的基团修饰偶联物，如脂肪酸链等。

在上篇文章中，着重介绍了什么是生物偶联，并得出结论设计最佳偶联方案是生物偶联成功与否的关键。在本篇文章中主要针对此问题提出一些个人的思路供大家参考，希望能对大家有所帮助。

一、明确预期用途与组分的选择：

偶联物的作用一定是明确的，而起作用则分别来自于各个组分功能，如常用的靶向功能，检测功能，毒性功能等。因此不仅要把控整体性能，各组分选择及其活性也至关重要。

IVD检测中常用的组分如抗体，酶，生物素，微球等都是很好的选择，相应能组成的偶联物也多种多样，如酶标抗体，生物素化抗体，微球标记抗体，生物素化核酸等。

二、多种偶联剂的选择

偶联剂的类型多种多样，如常用的同型多功能偶联剂戊二醛，异型多功能交联剂SMCC，两步法活化试剂NHS与EDC组合等。选择哪一种偶联剂首先取决各组分都有哪些可用基团，如常见的反应基团为-NH2和-COOH以及-CHO等。

其次注意偶联物的溶解性，如用于免疫液相检测，则希望偶联物的溶解度要强一些，可用亲水性较强的基团如-OH修饰偶联剂如PEG链修饰或磺酸化修饰以提高水溶性；如用于原为杂交或免疫组化等需要穿过某些介质如细胞膜或核膜等，则可用疏水性较强的基团修饰偶联物，如脂肪酸链等。

同时这些修饰也将影响偶联物的亲水性和疏水性，因为各组分最终连接的修饰物可能不止连接一个交联剂并这些交联剂会一直存在，最终影响偶联物整体的稳定性与非特异性。

确定某类偶联剂后，偶联剂结构或长度也是后续优化的一个方向，不同长度或分子量带来的电荷量或亲水性与疏水性也不一样，最终都将产生一定的蝴蝶效应。

三、明确反应条件

形成牢固结合的偶联物一般是通过共价反应来获得，如常见的氨基与羧基的反应，醛基与氨基的反应或者巯基与马来酰亚胺基团反应等。一般情况下提高温度，延长时间都能提高反应效率，但也需注意各组分的稳定性。

比如抗体与酶活性或药物活性可能对温度比较敏感，37℃反应可以提高反应效率，但通常4℃过夜反应也能达到预期结果，而低温对蛋白的稳定性也有所帮助。另外溶液的水和pH值也会一定程度带来水解作用，盐离子亦会影响生物分子溶解度，因此选择合适缓冲液作为反应基质也至关重要。

四、反应比例

包括交联剂的比例以及各组分的比例。通常来说，交联剂或者修饰试剂分子量比较小，而被标记的分子量比较大，本身携带的位点也会比较多，因此一般都会进行过量反应，如10倍或20倍等摩尔比等。

理论上比例越高，越有利于通过布朗运动发生结合，但是也不建议一下子大幅度过量反应。一个是高浓度下，尤其是刚混合阶段，由于局部浓度过高，如果是结合较多疏水性偶联剂可能直接出现沉淀或者影响最终产品稳定性；如果是荧光素素标记则可能出现结合多个荧光素而发生荧光淬灭，或者产生一个大范围的不同标记个数。

而各生物组分用量通常也可根据设计需求采用如等质量或其他质量比用于反应，最终比例也是需要通过进行几个梯度比例进行优化与确定。最后反应结束后，因为是过量反应，是否需要纯化等也是需要考虑的一个问题。

五、分子支架

在某些情况下，各组分均为比较合理的选择，但最终偶联物的效果表现却一般般，尤其是大分子之间的偶联，由于位阻的缘故，可能只有偶联一至两个。

此时，若能选择某一高分子聚合物作为分子支架也是不错选择。分子支架本身不作为预期的用途而使用，但却可提供足够的反应空间和位点用于多组分偶联，从而提高偶联物的灵敏度。分子支架可大可小，可以是某些单体分子聚合反应形成的链状或树枝状聚合物，如糖支链等，也可以是不相关的蛋白或者颗粒如BSA等，必要时可灵活运用。

六、知识贯通

进行偶联时，需要储备一定的知识，比如大致了解各组分的结构特征，携带的反应基团，活性位点，不同类型修饰对活性的影响等，如最基本的抗体重链与轻链，二硫键与糖侧链或者不同荧光染料激发波长与发射波长以及对应的检测仪器能否适用等。

另外，也可通过书籍了解技术的发展，如放射性免疫，酶免疫，荧光免疫，化学发光，分子诊断等，这些技术都或多或少地涉及偶联物的使用，因此了解前辈们在这些类似技术上的探索与深究对设计偶联也有一定参考价值。

当然也可以进行旧物新用，尝试将已经广泛使用的物质用于新的领域。将知识融会贯通不能保证马上成功，但能减少不确定的尝试，对设计偶联也会有一定的启发作用。

七、优化

存在即是合理，任何凭空制造的偶联物只有通过不断的优化以达到稳定的重复与量产，才能达到最终目的。

最后，偶联物生成后可能还涉及纯化与保存问题。一般通过过柱等方式可以快速完成纯化操作，此类分子筛有很多可用的商业用品可供选择。

保存液可根据组分来选择合适缓冲液，一般而言加入少量BSA，糖类，甘油和防腐剂等物质均有利于提高偶联物稳定性。

总而言之，设计偶联物之前，心中最好要有一定的蓝图，将各方面都先初步定下来再开始尝试，最终通过不断尝试将最初的设想变成可能。