hplc常用方法分别适用于什么（默克干货HPLC故障排除指南）

hplc常用方法分别适用于什么（默克干货HPLC故障排除指南）仅使用HPLC级溶剂、盐、离子对试剂和酸碱改性剂。清洁质量较低的溶剂非常耗时，通常会残留痕量的污染物。使用高灵敏度UV或荧光检测器时，这些痕量污染物可能会导致问题。水是反相分析中最常见的污染源。在配制流动相时，只能使用高纯度的蒸馏水或去离子水。然而，几种常见的脱离子剂会将有机污染物带入水中。要去除这些污染物，让去离子水通过活性炭或制备型C18柱。在HPLC系统中，引起问题的来源很多。首先界定问题，然后从源头上杜绝问题。使用表1确定是哪个或哪些组件造成的问题。通过排除法，通常可以帮助您查明具体原因并纠正问题。色谱图灵敏度低，基线上升、噪音、尖峰等通常因流动相所致。在梯度洗脱中，流动相中的污染物特别麻烦。它们可能会使基线上升，随着受污染的组分增加，可能出现伪峰。

如何识别、找出和纠正最常见的HPLC问题

尽管色谱柱技术和仪器的发展改进了HPLC方法，但仍然存在问题。在本指南中，我们为您提供了找出、识别和纠正诸多常见HPLC问题的系统方法。更多内容到默克sigma试剂官网查看：www.sigmaaldrich.cn

无论您使用模块化系统还是使用更精密的设备，HPLC系统的重要组成部分都是相同的。每个组件都可能出现影响总体系统性能的问题。本指南讨论了一些常见问题。本指南以易于使用的表格形式说明了这些问题的解决方案。

找出HPLC问题

在HPLC系统中，引起问题的来源很多。首先界定问题，然后从源头上杜绝问题。

使用表1确定是哪个或哪些组件造成的问题。通过排除法，通常可以帮助您查明具体原因并纠正问题。

色谱图灵敏度低，基线上升、噪音、尖峰等通常因流动相所致。在梯度洗脱中，流动相中的污染物特别麻烦。它们可能会使基线上升，随着受污染的组分增加，可能出现伪峰。

水是反相分析中最常见的污染源。在配制流动相时，只能使用高纯度的蒸馏水或去离子水。然而，几种常见的脱离子剂会将有机污染物带入水中。要去除这些污染物，让去离子水通过活性炭或制备型C18柱。

仅使用HPLC级溶剂、盐、离子对试剂和酸碱改性剂。清洁质量较低的溶剂非常耗时，通常会残留痕量的污染物。使用高灵敏度UV或荧光检测器时，这些痕量污染物可能会导致问题。

因为许多水相缓冲液会促进细菌或藻类的生长，所以应新鲜制备这些溶液，并在使用前进行过滤（0.2 μm或0.45 μm过滤器）。过滤还能够去除可能产生基线噪音或堵塞色谱柱的颗粒。通过向水相缓冲液中加入约100 ppm的叠氮化钠来防止微生物生长。也可将这些缓冲剂与20％或更高的有机溶剂（例如乙醇或乙腈）混合。

为防止系统中出现气泡，对流动相溶液脱气。通常首选在线脱气机，但如果流动相不含任何挥发性成分，则可以选择使用喷氦脱气。

小心使用离子对试剂。每次分析必须确定最佳链长和试剂浓度。浓度可低至0.2 mM，或高至150 mM或更高。通常，增加浓度或链长会增加保留时间。高浓度（> 50％）的乙腈或一些其他有机溶剂会沉淀离子对试剂。离子对试剂有些盐不溶于水并会沉淀。在存在长链磺酸（例如十二烷基硫酸钠）的情况下，应避免这种情况，用含钠缓冲液代替含钾缓冲液。

当您希望回收化合物用于进一步分析时，挥发性酸碱改性剂（例如三乙胺（TEA）和三氟乙酸（TFA））是有用的。这些改性剂还可以避免与离子对试剂相关的问题。它们还可以0.1至1.0％TEA或0.01至0.15％TFA的浓度添加至缓冲液中。增加浓度可以改善某些化合物的峰形，但会改变保留时间。

近年来，越来越广泛地回收用于等度分离的流动相，作为降低溶剂成本、处理成本和流动相制备时间的手段。溶剂回收器具可利用微处理器控制的开关阀，在检测到峰值时将溶剂流引导至废液箱。当基线低于所选阈值时，未污染的溶剂被引导回溶剂瓶。

图 A.HPLC系统的组成部分

泵必须在各种条件下向色谱柱提供恒定的溶剂流量。现代HPLC泵采用单活塞或双活塞、注射器或隔膜泵设计。

泵系统问题通常易于发现和纠正。一些较常见的问题包括色谱图中保留时间不稳定，基线噪音或尖峰。泵配件或密封件泄漏会导致色谱分析不良。泄漏的确切迹象是在泵连接处有盐析出。应每天用新鲜的去离子水 从系统中冲洗缓冲盐。要找出和修复与设备相关的特定问题，请参阅操作手册中的故障排除和维护部分。需要定期更换泵密封件。应定期进行维护，而不是等待问题发生。

进样器可快速地将样品导入系统，对溶剂流的干扰最小。HPLC系统目前采用可变环、固定环和针式进样器。进样器有手动、气动或电动驱动选择。

进样器的机械问题（例如，漏液、毛细管管线堵塞、密封件磨损）易于发现和纠正。使用柱前过滤器可防止因进样器密封件的物理老化而导致的色谱柱筛板堵塞。不可再现进样等其他问题，则较难解决。

定量环未完全填充、进样溶剂与流动相不相容或样品溶解度差，均可能导致峰高易变、裂峰和宽峰。尽可能在流动相中溶解和注入样品。否则，应确保进样溶剂的洗脱强度低于流动相（表3）。请注意，某些自动进样器使用单独的针筒清洗液。确保清洗液与流动相兼容且比流动相弱。在反相和正相分析之间切换时，这一点尤为重要。

虽然流动相入口过滤器、进样前过滤器、柱前过滤器、以及保护柱不属于大多数设备的必备部件，但它们大大减少了与复杂分离相关的问题。我们建议让所有样品经过0.45 μm或0.2 μm针筒过滤器过滤。我们强烈建议使用保护柱。

过滤器和保护柱可防止颗粒和强保留化合物积聚在分析柱上。这些一次性产品的使用寿命取决于流动相成分、样品纯度、pH值等。当这些装置被颗粒污染或堵塞时，压力增加，峰值变宽或分裂。例如，图B给出了使用保护柱的示例

无论色谱柱是否包含键合的反相或正相、离子交换、亲和性、疏水性相互作用、分子筛或树脂/硅基填料，与分析柱相关的最常见问题是劣化。劣化的迹象包括峰形差、裂峰、肩峰、解析度降低、保留时间减少和背压高。这些迹象表明污染物积聚在筛板或色谱柱入口处，或者填料层中存在空洞、沟槽或凹陷。

在高效柱中，劣化更明显。例如，与由2微米或更大筛板截留的5微米或10微米填料相比，由0.5微米筛板截留的3微米填料更容易堵塞。适当的色谱柱保护和样品制备对于发挥色谱柱的最大功效至关重要。

过载色谱柱会导致峰形差和其他问题。

色谱柱典型容量

色谱柱容量取决于多种因素，但色谱柱上分析物总量的典型值如下：

色谱柱类型色谱柱尺寸
色谱柱容量分析柱25 cm x 4.6 mm<500 μg半制备柱25 cm x 10 mm<100 mg制备柱25 cm x 21.mm<500 mg

检测器问题分为两类——电气和机械/光学问题。如有电气问题，请联系仪器制造商。机械或光学问题通常因流动池所致。与检测器相关的问题包括漏液、气泡和流通池污染。这些通常会引起色谱图出现尖峰或基线噪音或低灵敏度。

某些流通池，尤其是用于折射率检测器的流通池，对压力敏感。超过制造商建议的流速或背压将破坏流通池窗。旧灯或坏灯以及不正确的检测器上升时间、增益或衰减将降低灵敏度和峰高。电缆连接错误或反接也可能是导致问题的根源。

这些组件很少会导致系统出现问题。我们将在故障排除表（表1）中详细讨论这点。

大多数问题不会一夜之间发生，而是有个发展的过程。准确地保存记录对于发现和解决许多问题来说至关重要。

评估您所收到的每个色谱柱，并在日后进行定期评估。通过保存色谱柱柱效、所使用的流动相、灯电流、泵性能等的书面记录，您可以监控系统的性能。

记录还有助于防止错误，例如将水导入硅胶柱，或因添加过多的有机溶剂而使系统中的缓冲液发生沉淀。许多分析员会对HPLC系统做一些修改。可靠的记录是确保修改不会导致问题的最佳方法。与泵、检测器、自动进样器和数据系统相关的问题，请参阅仪器手册的故障排除指南。