活性成分紫锥菊（紫锥菊提取物对环磷酰胺免疫抑制小鼠免疫功能影响的研究）
活性成分紫锥菊（紫锥菊提取物对环磷酰胺免疫抑制小鼠免疫功能影响的研究）实验设3个免疫试验大组，每个组小鼠50只，分别为正常对照组、免疫抑制对照组、紫锥菊提取物高、中、低剂量组，每组10只小鼠。除正常对照组外，各组小鼠腹腔注射环磷酰胺（100mg/kg.bw），每天1次，连续3天，建立免疫抑制模型小鼠[2]。建模后高、中、低剂量组分别按240mg/kg.bw、120mg/kg.bw、60mg/kg.bw水平，正常对照组、免疫抑制对照组给予等量的纯化水，以20ml/kg.bw灌胃体积，每天1次，连续30d后测定各项免疫指标。其中试验一组用于免疫器官指数及碳廓清试验；试验二组用于血清溶血素值的测定；试验三组用于脾淋巴细胞增殖转化实验。1.2.1动物造模、分组及给药1.1.2药材与试剂：紫锥菊提取物，HPLC检查，指纹图谱与紫锥菊提取物对照品图谱吻合。含量测定：菊苣酸≥2.0%，多酚≥4.0%。印度墨汁、RPMI1640细胞培养液、Hank s平衡盐溶液、胎牛血清、
长期以来，中小规模养殖场的生产设施相对落后及缺乏畜禽养殖专业知识，养殖场为了预防生产中动物疾病的发生，长期和大量的使用动物保健药物，造成畜禽机体处于应激状态甚至免疫抑制情况的发生。因此，科研人员研发了各种免疫调节剂为应对生产中出现的这些问题。随着农产品中残留化合物监管的日益广泛和严格，天然的植物药物成为理想的选择。紫锥菊(Echinacea)是原产于美洲的一类菊科野生花卉，作为免疫调节剂在国际上受到普遍重视，在美洲作为免疫促进剂和调节剂用于流行感冒的治疗[1]。对免疫力低下的生理状态有比较理想的免疫作用效果。本试验拟通过研究紫锥菊提取物对环磷酰胺免疫抑制小鼠免疫调节作用，为开发新型、安全、低毒的畜禽免疫调节剂奠定基础。
1、材料和方法
1.1试验材料
1.1.1实验动物：SPF级昆明小鼠150只，雄性，体重18g～22g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。
1.1.2药材与试剂：紫锥菊提取物，HPLC检查，指纹图谱与紫锥菊提取物对照品图谱吻合。含量测定：菊苣酸≥2.0%，多酚≥4.0%。印度墨汁、RPMI1640细胞培养液、Hank s平衡盐溶液、胎牛血清、刀豆蛋白A（ConA）、MTT、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、都氏试剂，绵羊红细胞(SRBC)。
1.1.3仪器设备：二氧化碳培养箱(德国BINDER，C170)；紫外可见分光光度计(日本岛津公司，UV-2700)；高压蒸汽灭菌器(济南德强仪器有限公司，MJ-3780D)；酶标仪(瑞士Tecan，Infinite 200 Pro)；离心机(sigma公司，3K15)；显微镜(日本Olympus，CX31)；恒温水浴锅(上海科恒实业发展有限公司)；电子天平(UX820S，日本岛津公司；XS-105，梅特勒公司)。
1.2试验方法
1.2.1动物造模、分组及给药
实验设3个免疫试验大组，每个组小鼠50只，分别为正常对照组、免疫抑制对照组、紫锥菊提取物高、中、低剂量组，每组10只小鼠。除正常对照组外，各组小鼠腹腔注射环磷酰胺（100mg/kg.bw），每天1次，连续3天，建立免疫抑制模型小鼠[2]。建模后高、中、低剂量组分别按240mg/kg.bw、120mg/kg.bw、60mg/kg.bw水平，正常对照组、免疫抑制对照组给予等量的纯化水，以20ml/kg.bw灌胃体积，每天1次，连续30d后测定各项免疫指标。其中试验一组用于免疫器官指数及碳廓清试验；试验二组用于血清溶血素值的测定；试验三组用于脾淋巴细胞增殖转化实验。
1.2.2碳廓清试验及免疫器官指数测定
印度墨汁原液用生理盐水稀释4倍，各组小鼠尾静脉注射10ml/kg.bw，注射墨汁后2min、10min，分别从内眦静脉丛取血20µl，立即加入到2ml0.1% Na2CO3溶液中。以0.1% Na2CO3溶液作溶剂对照，600nm波长处测定各试验组光密度值（OD）。采血结束，称重后颈椎脱臼处死小鼠，取出胸腺、肝脏和脾脏，去掉筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重，计算吞噬指数（a），同时计算胸腺/体重比值与脾脏/体重比值。
1.2.3半数血清溶血素值（HC50）测定
每只小鼠腹腔注射0.2ml 2%（V/V）SRBC，致敏后5d，摘除眼球取血，2000r/min离心10min，收集血清。将血清用SA缓冲液稀释200倍，测定半数溶血值（HC50）。
1.2.4 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖转化实验
无菌取脾，置于盛有约5mlHank’s液平皿中，用镊子将脾磨碎，经过200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，1000r/min离心10min。将细胞悬浮于1640完全培养液中，调整细胞密度为3×106个/ml。将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加入75µlConA液，另一孔作为对照，置于5%CO2，37℃培养箱中培养72h，培养结束前4h，每孔轻轻吸取上清液0.7ml，加入0.7ml不含胎牛血清的RPMI1640培养液，同时加入5.0mg/ml的MTT溶液50µl，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，然后分装到96孔培养板中，每孔作3个平行孔，570nm波长测定光密度值（OD值）。
2、试验结果
2.1紫锥菊提取物对小鼠碳廓清能力的影响
Effect of different doses of Echinacea extract on carbon clearing ability
|
组别 |
动物数(只) |
吞噬指数（a） |
|
正常对照组 |
10 |
6.02±0.50 |
|
免疫抑制对照组 |
10 |
4.45±0.53a |
|
紫锥菊提取物低剂量组 |
10 |
5.08±0.43 |
|
紫锥菊提取物中剂量组 |
10 |
6.01±0.60b |
|
紫锥菊提取物高剂量组 |
10 |
5.95±0.62b |
(a．P＜0.05 与正常对照组比较 ；b. P＜0.05与免疫抑制对照组比较)
由表1可见，免疫抑制对照组的碳廓清能力显著低于正常对照组（P＜0.05）。给予环磷酰胺免疫抑制模型小鼠不同剂量紫锥菊提取物30d后，各剂量组均能恢复免疫抑制小鼠下降的碳廓清能力，低剂量组恢复能力与免疫抑制组比较差异不大（P＞0.05），中、高剂量组恢复能力与免疫抑制组比较有显著性增高（P＜0.05），而且中剂量组能够恢复到正常的水平。
2.2紫锥菊提取物对小鼠免疫器官指数影响
表2对免疫器官指数影响的结果（ ±s）
Tab.2 Effects of different doses of Echinacea extract on immune organ index
|
组别 |
动物数(只) |
脾脏体重比(mg/g) |
胸腺体重比((mg/g) |
|
正常对照组 |
10 |
4.42±0.29 |
2.95±0.16 |
|
免疫抑制对照组 |
10 |
1.99±0.69a |
1.01±0.24a |
|
紫锥菊提取物低剂量组 |
10 |
4.18±0.68b |
2.70±0.44b |
|
紫锥菊提取物中剂量组 |
10 |
4.21±0.55b |
2.72±0.48b |
|
紫锥菊提取物高剂量组 |
10 |
4.11±0.71b |
2.89±0.50c |
(a．P＜0.05 与正常对照组比较 ；b. P＜0.05，c. P＜0.01 与免疫抑制对照组比较)
由表2可见，免疫抑制对照组的胸腺和脾脏指数显著低于正常对照组（P＜0.05）。给予环磷酰胺免疫抑制模型小鼠不同剂量紫锥菊提取物30d后，低，中、高各剂量组均能显著提高免疫抑制小鼠的胸腺和脾脏指数（P＜0.05， P＜0.01）。
2.3紫锥菊提取物对小鼠血清溶血素值的影响
表 3对小鼠血清溶血素值的影响（ ±s）
Tab.3 Effects of different doses of Echinacea extract on serum hemolysin levels
|
组别 |
动物数(只) |
半数溶血值（HC50） |
|
正常对照组 |
10 |
179.8±14.3 |
|
免疫抑制对照组 |
10 |
160.2±15.5a |
|
紫锥菊提取物低剂量组 |
10 |
159.2±17.8 |
|
紫锥菊提取物中剂量组 |
10 |
175.9±14.7b |
|
紫锥菊提取物高剂量组 |
10 |
176.7±11.3b |
(a．P＜0.05 与正常对照组比较 ；b. P＜0.05，与免疫抑制对照组比较)
由表3可见，免疫抑制对照组的血清溶血素值显著低于正常对照组（P＜0.05）。给予环磷酰胺免疫抑制模型小鼠不同剂量紫锥菊提取物30d后，低剂量组血清溶血素值与免疫抑制组比较差异不显著（P＞0.05），中、高剂量组血清溶血素值与免疫抑制组比较有显著性提高（P＜0.05）。
2.4 紫锥菊提取物对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞增殖转化结果的影响
表4对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化结果的影响( ±s)
Tab.4 Effects of different doses of Echinacea extract on spleen lymphocyte transformation abilities
|
组别 |
动物数(只) |
淋巴细胞增殖能力(OD差值) |
|
正常对照组 |
10 |
0.560±0.143 |
|
免疫抑制对照组 |
10 |
0.160±0.169a |
|
紫锥菊提取物低剂量组 |
10 |
0.223±0.150 |
|
紫锥菊提取物中剂量组 |
10 |
0.336±0.122 |
|
紫锥菊提取物高剂量组 |
10 |
0.528±0.229b |
(a．P＜0.05 与正常对照组比较 ；b. P＜0.05与免疫抑制对照组比较)
由表4可见，免疫抑制对照组的脾淋巴细胞转化结果显著低于正常对照组（P＜0.05）。给予环磷酰胺免疫抑制模型小鼠不同剂量紫锥菊提取物30d后，低、中剂量组脾淋巴细胞转化结果与免疫抑制组比较差异不显著（P＞0.05），高剂量组脾淋巴细胞转化结果与免疫抑制组比较有显著性提高（P＜0.05）。
3、讨论
紫锥菊别名紫松果菊，花托为圆锥形，因其头状花序形似松果而得名，其主要功能成分为多糖、烷基酰胺类化合物和咖啡酸类衍生物。吴江涛[3]等研究显示紫锥菊提取物可以增强氢化可的松免疫抑制小鼠的单核巨噬细胞吞噬功能。王树琴[4]等研究表明紫锥菊提取物对肉鸡体液免疫和细胞免疫均起到促进作用。巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，其吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志之一，小鼠碳廓清试验中所测得的吞噬指数可反映单核-巨噬细胞的吞噬能力[5-6]。实验结果表明各剂量组均能恢复免疫抑制小鼠下降的碳廓清能力，中、高剂量组恢复水平与免疫抑制组比较有显著性增高（P＜0.05），而且中剂量组能够恢复到正常的水平，其原因可能与中草药的免疫调节作用的双向性有关。免疫器官按其功能可分为中枢免疫器官和外周免疫器官 胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，其脏器系数在一定程度上可以反映机体的免疫功能［7］。实验表明紫锥菊提取物低，中、高各剂量组均能显著提高免疫抑制小鼠的胸腺和脾脏指数（P＜0.05， P＜0.01）。血清溶血素试验和脾淋巴细胞转化试验是评价机体体液免疫和细胞免疫功能的经典试验，实验结果表明中、高剂量组血清溶血素值与免疫抑制组比较有显著性提高（P＜0.05），高剂量组脾淋巴细胞转化结果与免疫抑制组比较有显著性提高（P＜0.05）。表明紫锥菊提取物可以增强免疫抑制小鼠的体液和细胞免疫水平，其免疫调节作用可能与紫锥菊提取物能够增强淋巴细胞功能 刺激细胞因子和抗体的产生有密切关系，其相应的复杂药理机制还需进一步研究。
因此，紫锥菊提取物具有调节环磷酰胺免疫抑制小鼠非特异性和特异性免疫的作用，是一种效果极好的免疫调节剂，如果在生产中能够合理使用，可以很好的增加疾病的预防效果。
