碱性条件下检测重金属的显色剂（动物源性食品中有害化学物质及污染物的检测）

碱性条件下检测重金属的显色剂（动物源性食品中有害化学物质及污染物的检测）同时，芳香环上的取代基团还影响着BAA在畜禽组织中的代谢过程。比如儿茶酚类异丙肾上腺素和多巴酚丁胺的3-羟基很容易被儿茶酚O位甲基转移酶（COMT）甲基化从而迅速失活，而其他位的羟基则对COMT有抵抗力，这一特性严重影响了它的口服效果。雷索酚型（特布他林、非诺特罗）、水杨醇型（沙丁胺醇、沙美特罗）和苯酚型（莱克多巴胺、利托君）等BAA不是COMT的底物，但它们能够被肝脏和肠道中的酶类灭活。克伦特罗、马布特罗等分子中的苯羟基被卤素原子取代，这些分子不能与一些生物酶结合，从而阻止了这些BAA的代谢失活。卤素原子取代较苯羟基取代的BAA具有更高的亲脂性。因此其在脂肪组织中具有很高的分布速度。这些特性造成了克伦特罗等物质在机体内残留时间较长、消除缓慢。芳香环是BAA发挥其生物学效应的关键结构。一般情况下在BAA苯环上可以有如下取代基团：羟基、卤素、氨基、羟甲基、氰基或者是这些基团的结合。芳香环上的

β2-受体激动剂（β2-adrenergic agonist，BAA）是一类能与肾上腺素受体结合并能激活该受体，产生肾上腺素样作用的药物总称，又可称为拟交感胺类药物。其药理作用极强，具有松弛支气管平滑肌、增强纤毛运动和促进痰液排出的功能，主要用于人和动物的支气管肺炎等呼吸系统疾病的防治。20世纪80年代初，其因可以明显地促进动物生长、提高胴体瘦肉率、减少脂肪沉积和提高饲料转化率，被广泛用于动物生产中。但研究发现，长期使用该类药物，其极易在动物性产品中蓄积，对食用者的安全造成潜在的危害，且急性中毒事件时有发生，因此世界各国对该类药物进行了禁用或限用规定，我国也规定在食品动物中严禁使用该类药物。本部分综述了BAA的化学结构与理化性质、药理与毒理作用、药动学及残留消除特征、国内外限量要求以及残留检测的样品前处理、仪器测定方法等内容，以期为该类药物的全面了解和残留检测提供参考。

1化学结构与理化性质

BAA类药物因具有苯乙醇胺结构母核（图7-7），故又称为苯乙醇胺类（phenylethanolamine，PEA）。其苯环上连接有碱性的β-羟胺（仲胺）侧链，侧链的取代基通常为N-叔丁基、N-异丙基或N-烷基苯。按照分子母核中苯环上取代基的差异，可分为苯胺型和苯酚型两大类。

苯胺型一般具有芳伯胺基，如克伦特罗、溴布特罗、马布特罗、马喷特罗、塞曼特罗。苯酚型又可分为邻苯二酚型（儿茶酚型，肾上腺素、异丙肾上腺素）、间苯二酚型（雷索酚型，非诺特罗、特布他林、异丙喘宁）和水杨醇型（如沙丁胺醇、吡布特罗）。

1.1 药物的取代基团

BAA的化学结构主要由3个活性基团组成：芳香环、β-羟基和脂肪胺基。这些基团形成的特异结构构成了与β-肾上腺素受体（β-AR）的结合位点。其基本结构中芳香环的邻位、对位和脂肪链末端的R位上可有不同取代基（表7-3）。

1.1.1 芳香环

芳香环是BAA发挥其生物学效应的关键结构。一般情况下在BAA苯环上可以有如下取代基团：羟基、卤素、氨基、羟甲基、氰基或者是这些基团的结合。芳香环上的取代模式对BAA的生物活性有着重要影响，因为BAA苯环上邻位或对位上的碳原子与受体蛋白上丝氨酸的羟基通过氢键结合。因此苯环上的羟基必须暴露出来才能维持分子的活性，例如班布特罗必须羟基化形成特布他林才有活性，另外沙丁胺醇对位羟基结合葡萄糖醛酸后即失去活性。而C7、C8对位羟基化后比非羟基化的原型物质活性更高。

同时，芳香环上的取代基团还影响着BAA在畜禽组织中的代谢过程。比如儿茶酚类异丙肾上腺素和多巴酚丁胺的3-羟基很容易被儿茶酚O位甲基转移酶（COMT）甲基化从而迅速失活，而其他位的羟基则对COMT有抵抗力，这一特性严重影响了它的口服效果。雷索酚型（特布他林、非诺特罗）、水杨醇型（沙丁胺醇、沙美特罗）和苯酚型（莱克多巴胺、利托君）等BAA不是COMT的底物，但它们能够被肝脏和肠道中的酶类灭活。克伦特罗、马布特罗等分子中的苯羟基被卤素原子取代，这些分子不能与一些生物酶结合，从而阻止了这些BAA的代谢失活。卤素原子取代较苯羟基取代的BAA具有更高的亲脂性。因此其在脂肪组织中具有很高的分布速度。这些特性造成了克伦特罗等物质在机体内残留时间较长、消除缓慢。

1.1.2 脂肪胺基

脂肪胺基上的 N 经质子化作用后使 BAA通常具有碱性的 pKa，这就使其不易分配进入脂肪组织除非分子的其他部分有更强的亲脂作用。常见的BAA通常不亲脂，其商业成品所采用的盐类形式易溶于水和乙醇，但溶液pH升至10或更高时，它可从水溶液中析出而进入二氯甲烷等有机溶剂中。

在生理情况下（pH7.4），BAA的烷基胺在血液或其他组织中常发生质子化而使其具有碱性的pKa。例如非诺特罗的pKa为5.5或10；异丙肾上腺素为10.1；莱克多巴胺为9.4；沙丁胺醇为9.3；特布他林为10.1。烷基胺只有发生质子化后才能与受体结合而表现出生物活性。

1.1.3 羟基

苯乙醇胺类BAA的β-碳原子具手性结构，可形成各种光学异构体。在生理情况下，只有左旋异构体才能与受体结合表现出生理活性，因此临床上大多数BAA都为左旋异构体。

1.2 理化性质

BAA结构中含有1或2个手性碳，故分子具有旋光性。BAA为白色晶体，游离碱溶于多数极性或中等极性溶剂，如稀酸（苯胺型、苯酚型）、稀碱（苯酚型）、甲醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿等。临床上一般用其盐酸盐，易溶于水和甲醇、乙醇等高极性溶剂，但在非极性或疏水溶剂中难溶。在不同pH下的解离状态影响其溶解性。多数PEA为中等极性的疏水性物质，呈弱碱性（苯胺型）或酸碱两性（苯酚型）。

BAA由于具有苯环，在220~280nm处存在紫外吸收。如盐酸克伦特罗的吸收峰为243nm、296nm，盐酸沙丁胺醇的吸收峰为274nm，含酚羟基的BAA特别是雷索酚型和儿茶酚型的还具有荧光性质，如沙丁胺醇的激发波长和发射波长分别为255nm和310nm。

2药理作用

克伦特罗等BAA的化学结构与肾上腺素类药物相似，属拟肾上腺素类药物，与组织细胞膜上的β-肾上腺素受体（β-AR）结合，通过刺激鸟苷酸结合蛋白（G蛋白）作用于腺苷酸环化酶，使之活化，活化的腺苷酸环化酶使三磷酸腺苷（ATP）转变为环磷酸腺苷（cAMP），cAMP激活蛋白激酶K或其本身被磷酸二酯酶作用而失活促使酶的磷酸化，从而产生系列效应（图7-8）。

BAA的药理作用主要表现为：对支气管、子宫和血管平滑肌β2-受体有较高的选择性激动作用，能有效地解除支气管痉挛。此外，还有较强的抗过敏和明显增强支气管纤毛活动的作用，并作用于溶酶体，能促进黏液溶解，有利于痰液的排出。该类药物由于使用量少，且用药后起效快、维持时间长，临床上主要用于支气管哮喘与喘息型支气管炎，是防治支气管哮喘和支气管痉挛的主要药物。同时其因对子宫平滑肌有较强的松弛作用，也用于延迟分娩。

BAA除具有良好的平喘作用外，还可使体内脂肪分解加强，血中游离脂肪酸增加，摄入的能量不再形成脂肪储存于体内，而是立即为蛋白质的合成所利用，并抑制蛋白质分解，促使胰岛素释放和糖原分解加强，因此它具有营养重分配的作用，即体内脂肪分解代谢增强，蛋白质合成增加，能显著提高酮体的瘦肉率、增重和饲料转化率。BAA与β2-受体结合后可以引起肌肉中环磷酸腺苷和乳酸浓度的快速升高，肌糖原浓度下降，加快肌肉蛋白质的合成速度，长期使用能增加肌肉体积、增加体重。如克伦特罗还可以使蛋白激酶活化，活化的蛋白激酶可以灭活乙酰辅酶A羧化酶和甘油三酯合成酶，而提高激素敏感酯酶和甘油三酯分解酶的活性，这种变化一方面促进脂肪的分解，另一方面减少脂肪的合成。

20世纪80年代初，一系列动物试验表明当用药量超过推荐治疗剂量的5倍时，一些苯乙胺类药物如克伦特罗、沙丁胺醇、马布特罗等可促进动物（如牛、猪、羊、家禽等）生长，使体内的脂肪分解代谢增强、蛋白质合成增加，能显著提高瘦肉率。动物食入后，脂肪在体内沉积减少，且提高了胴体的瘦肉率，一般可使猪瘦肉增加约10%，肉鸡瘦肉增加5%~10%，肉鸭瘦肉增加13.2%~21.04%，牛、羊更高，故俗称为“瘦肉精”。所以自20世纪80年代以来，BAA被大量非法地添加于饲料中，以促进家畜生长和提高瘦肉率。

3毒理作用

通常作为药物饲料添加剂用于促生长目的，剂量通常超过5mg/kg，这也成为导致畜禽中毒和在动物食品中残留的主要原因。当人体中累计摄入剂量超过一定值或摄入高残留的内脏组织时，易出现急性中毒症状，表现为面色潮红、头痛、头晕、乏力、胸闷、心悸、骨骼肌震颤、四肢麻木等一系列不良反应。心电图检查可出现心动过速，严重者可发生室上性期外收缩和心房颤动。实验室检查可见白细胞增多，低血钾，血液中乳酸、丙酮酸含量升高，并可出现酮体，同时可出现血清心肌酶、肌钙蛋白水平增高。对于原有心律失常、高血压、青光眼、糖尿病、甲状腺功能亢进、前列腺肥大等疾病的患者，上述症状更易发生，甚至会危及生命。

4药动学及残留消除特征

BAA在动物体内的药动学过程也曾被做过深入的研究。BAA口服或注射给药均易吸收，人口服克伦特罗后血药浓度在2~3h达到峰值，且全身分布，家畜也有类似的结果。BAA吸收后，在肝脏进行代谢，主要经尿和胆汁排出，但因BAA种类和动物种类的不同而有差异，克伦特罗和沙丁胺醇（SAL）在奶牛体内还可排泄至乳中。含有卤素的药物血浆半衰期长，如克伦特罗一般通过氧化方式被代谢，大部分以原型排出体外，被氧化的部分药物排出后即会失去生物活性，所以活体监测克伦特罗的排出量时，只检测具有生物活性的克伦特罗原型部分。而含酚羟基的药物血浆半衰期相对较短，只能通过结合方式被代谢，如SAL主要以硫酸酯结合物和葡萄糖苷酸结合物的形式排出，如人尿液中48%的SAL为硫酸酯轭合物、32%为原型。莱克多巴胺（RAC）在小鼠、猪、牛体内则主要以葡萄糖苷酸结合物的形式排出，且结合物具有3~4种同分异构体。因此监测含有酚羟基的BAA的排出量时，有必要将轭合的部分转化为药物原型。

以14C标记的莱克多巴胺在动物体内的研究表明，口服给药吸收迅速，大鼠给药后0.5~2h血浆及全血中药物达峰浓度，在0.5~2mg/（kg·d）的剂量范围内雌性大鼠和雄性大鼠的血浆及全血中药物浓度水平相似，但在20mg/（kg·d）的给药剂量上，雌性大鼠体内的血浆及全血中药物浓度水平较雄性大鼠要高2.5倍左右。雄性及雌性大鼠体内的消除半衰期约为7h，但雄性大鼠以20mg/（kg·d）剂量给药时消除半衰期延长为15h，原因未明。犬以0.05mg/（kg·d）、0.5mg/（kg·d）、5mg/（kg·d）的剂量胃管给药后达峰时间为4~8h，血浆及全血中药物消除半衰期约为6h。

RAC在小鼠体内的吸收与排泄都非常快，口服给药后0.5h即达到血药浓度的最高峰，给药总量的55%在给药后8h经胆汁排出，65%在给药后24h排出。Dalidowicz等报道，饲料中以20mg/kg的浓度添加RAC后给猪饲喂5d（每天2次），最后一次给予40mg放射物标记的RAC，停药后24h内84.7%的标记物经尿排出，72h内95.4%的标记物经尿排出。饲料中按30mg/kg的浓度添加RAC后给猪饲喂4d、7d、10d，停药后12h屠宰，肌肉、肾脏和肝脏中的浓度分别为0.019~0.024mg/kg、0.466~0.655mg/kg和0.254~0.424mg/kg。

5国内外限量要求

鉴于BAA残留的毒副作用，人类食用了含有BAA残留的畜产品会引发食物中毒，欧盟早在1985年就禁止BAA作为饲料添加剂使用，并且规定了严格的处罚措施。但由于BAA的非法使用，在随后的几年内发生了多起克伦特罗中毒事件。Martinez首次报道了克伦特罗导致的中毒事件，在1989年至1990年，在西班牙中部有135人由于误食被克伦特罗污染的牛肝而集体中毒，其中有43个家庭均曾食用此种牛肝，有97%的家庭的患者表现此药中毒的典型病状；而后，法国、西班牙、意大利等国家先后发生了多次因食用克伦特罗残留的动物产品中毒的事件。因此欧盟采取更加严密的措施，通过一系列法规严格禁止BAA作为饲料添加剂使用。有些国家执行MRL限制，如英国规定BAA在动物组织中的MRL为0.5ng/g，荷兰规定的MRL为1ng/g。

美国在20世纪90年代初使用克伦特罗作为动物促生长剂，但都是用于非上市动物。欧洲的中毒事件促使美国FDA也禁止克伦特罗、SAL等多种BAA作为生长促进剂使用。但美国允许盐酸莱克多巴胺用作猪、牛的生长促进剂，动物屠宰上市前无须休药期。RAC在美国的商品名为paylean，由美国Elanco animal health公司（Eli Lilly公司的子公司）成功开发并被美国FDA于2000年7月批准可应用于养猪，2001年被批准用于养牛，这也是迄今为止唯一一种被美国批准应用于食品动物以提高瘦肉率的药物。市场销售的产品主要是莱克多巴胺盐酸盐，可以直接加入饲料中制成饲料预混剂饲喂，美国规定每千克饲料约含莱克多巴胺盐酸盐19.82g。

在我国，早在1997年3月，我国农业部（农牧发[1997]3号）就严令禁止BAA在畜牧生产中作为饲料添加剂使用。2000年，国家对严厉打击非法使用盐酸克伦特罗发出紧急通知（农牧发[2000]4号），2002年农业部发布的禁用药物清单中明确规定禁止克伦特罗、SAL、莱克多巴胺、塞曼特罗、特布他林及其制剂在食品动物的饲养过程中使用（176号公告、193号公告、235号公告等）。2010年，农业部1519号公告发布了禁止用于食品动物的14种具有促生长作用的药物。迄今为止，我国已明确规定了在食品动物养殖过程中禁止使用克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、苯乙醇胺A、氯丙那林、多巴胺、班布特罗、齐帕特罗、马布特罗、西布特罗、溴布特罗、福莫特罗、阿福特罗13种药物及其相应的盐及酯。

6检测技术

鉴于对BAA残留监控的需要，国内外学者对该类药物的检测方法进行了广泛而深入的研究。目前对BAA类药物残留检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、气质联用分析法（GC-MS）、高效薄层色谱法（HPTLC）、液质联用分析法（LC-MS）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）和放射受体分析法等。

样品前处理中，液-液萃取（LLE）法、固相萃取（SPE）法、免疫亲和色谱（IAC）是提取和净化的基本方法。BAA的理化性质差别较大，极性较高的苯酚型药物在样品前处理中回收率较低，因此在多残留分析中多采用组合SPE柱或SPE与IAC相结合的方式。

6.1 样品前处理方法

6.1.1 样品的水解

BAA在动物体内经过吸收、生物转化、代谢消除后，部分药物常以硫酸轭合物或者葡萄糖醛酸轭合物的形式存在，尤其是苯酚型BAA，如沙丁胺醇、特布他林的轭合物比例较高，因此样品要先进行水解，使待测物游离或从组织中释放以进行后续的溶剂提取。常用的方法有酸水解法、酶水解法和碱水解法，或者酶解与酸解的结合法。

6.1.1.1 酶水解法

酶水解法常采用的水解酶主要有枯草杆菌蛋白酶、葡萄糖苷酸酶、硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶。其中，葡萄糖苷酸酶、硫酸酯酶或其混合酶系是最常用的水解酶。水解条件对水解效率有显著影响。温度和pH直接影响酶的活性，要严格控制。通常在样品中加入缓冲溶液以控制pH，如Lucia等测定牛尿中的BAA残留，先将牛尿用乙酸缓冲液调pH至52，然后用葡萄糖苷酸酶/硫酸酯酶在55℃条件下水解2h。水解完成后一般采用高温煮沸的方法将酶破坏。

6.1.1.2 酸水解法

酸水解法一般在稀盐酸、稀磷酸或稀高氯酸溶液中进行。稀酸除具有水解轭合物的作用，还起到沉淀蛋白质的作用。用稀酸水解轭合物时一般采用水浴超声辅助提取，然后在一定温度的水浴中水解1h。因此酸水解的过程也是提取过程。采用酸水解法提取的样品干扰物质少。Mauro等将尿液用葡萄糖苷酸酶/硫酸酯酶酶解后，将pH调节到7.5左右，直接进行SPE净化，用UPLC-MS/MS进行检测；该方法直接将酶解与提取合并。

6.1.1.3 碱水解法

碱水解法常用于毛发样品中轭合物的水解，一般操作比较简单。Regiart等将100mg牛毛样品经1%SDS溶液和水洗涤、干燥后，加入2.5mL5mol/L氢氧化钠溶液，95℃孵育10min，冷却至室温，用3mL叔丁基甲醚超声15min后在室温条件下混合15min，重复提取一次，合并上清液，氮气吹干复溶，用IAC柱净化。Fente等用1mol/L的氢氧化钠溶液在80℃下作用1h以水解牛毛发，测定其中的BAA残留。

6.1.2 样品的提取

样品的提取和水解通常可以同时进行，也可以先水解后提取或先提取后水解。BAA属于中等极性的疏水性物质，呈弱碱性（苯胺型）或酸碱两性（苯酚型），样品可用极性溶剂、酸性或缓冲溶液进行提取。有机溶剂和pH是影响提取效率的重要因素。同时采用振荡、超声、匀浆等方法辅助可以提高提取效率。由于样品的提取过程通常也是样品净化的一部分，尤其是进行LLE时，故该部分内容主要在LLE部分进行阐述。

6.1.3 样品的净化

6.1.3.1 LLE

大多数BAA为中等极性的疏水性物质，呈弱碱性（苯胺型）或者酸碱两性（苯酚型），酸性条件下易溶于水，碱性条件下易溶于有机溶剂，一般先调节样品的pH，使其高于BAA的pKa，即pH＞9，然后用极性疏水溶剂（如乙酸乙酯-异丙醇、异辛烷-二氯甲烷、乙醚-二丁醇、正己烷-正丁基甲酯等）进行萃取净化。由于使用混合溶剂萃取能获得更高的选择性，即可选用LLE对样品进行提取和净化。生物样品中BAA常用的提取溶剂有极性有机溶剂、稀酸、缓冲液，或者将上述不同溶剂结合使用。BAA在不同的pH下的解离状态影响其溶解性，一般先调节样品的pH高于其pKa，再进行有机溶剂提取。有机溶剂和pH直接影响提取效率。Turberg等用甲醇提取猪和火鸡组织中的莱克多巴胺，经LC测定。Fredy等建立检测牛肝脏中克伦特罗的HPLC-UV方法，5g牛肝脏加入4mL乙腈和1.2g氯化钠、4g硫酸钠、0.5g硫酸镁，涡旋混匀，2 000g离心15min，将上清液用氮气吹干，用1mL流动相溶解后，进行HPLC-UV检测。

6.1.3.2 SPE

SPE是目前BAA残留分析中应用最广泛的一种样品净化方式，它建立在传统的LLE基础之上，结合物质相互作用的相似相溶机理和目前广泛应用的HPLC、GC中的固定相基本知识逐渐发展起来的。与LLE相比，SPE更有效，容易达到定量萃取，快速和自动化，同时也减少了溶剂用量和工作时间，所以SPE具有有机溶剂用量少、便捷、安全、高效等特点。

在BAA残留净化分析中使用的SPE柱种类繁多，如C18柱、混合型离子柱（OasisMCX、CleanertPCX）、强阳离子柱（ProElutSCX）、亲水亲脂柱（OasisHLB）、中性氧化铝柱、分子印迹高分子SPE柱、ExtrelutSPE柱、碳纳米管SPE柱等。这些SPE柱的洗脱剂一般为2%~3%的氨化甲醇或氨化乙腈溶液。对于多残留组分或复杂样品一般采用组合SPE柱或混合阳离子交换柱进行净化。Leyssens等先将牛尿和猪肝以Tris缓冲液（pH＝8）匀浆，将匀浆液用枯草杆菌蛋白酶A酶解，调酶解液pH＝9.8后用正丁醇-乙酸乙酯（3∶7，V/V）萃取，有机相浓缩复溶后用中性氧化铝柱进行初级净化，再调样品pH＝6.0，通过BondElutCerti柱，用含2%氨水的二氯甲烷-异丙醇（8∶2，V/V）洗脱，净化效果良好，样品衍生后采用GC-MS测定，不同残留组分的检测限为0.5~5ng/g。Chen等直接将牛奶样品加内标后，直接利用HLBSPE柱进行净化后进行LC-MS/MS检测。Philippe等将C18柱与强阳离子固相萃取柱（SCX-SPE）联合使用分离牛肉和猪肝中的克伦特罗，以LC-MS测定，当加标水平为0.4ng/g时，回收率为63%±7%。

6.1.3.3 IAC

IAC原理是将抗体固定在固相载体材料上，制成免疫亲和吸附剂，将样品溶液通过吸附剂，样品中的目标化合物因与抗体发生免疫亲和作用而被保留在固相吸附剂上。然后用缓冲液或有机溶剂作为洗脱剂洗脱固定相，使目标化合物从抗体上解离，从而使目标化合物被萃取和净化。由于免疫亲和作用具有很高的特异性，所以免疫亲和柱可以高选择性地从复杂样品基质中分离其他萃取方法难以萃取的目标化合物。由于抗原-抗体反应具有高灵敏、高选择、高特异性等特点，可选择性吸附样液中的待测组分，而去除脂类、蛋白质类、糖类等各类杂质，从而大大提高了样品的净化效果及检测灵敏度。IAC以其高效选择性保留能力在BAA残留的净化中具有独特的作用，应用广泛。在很多文献报道中，IAC是BAA残留的关键净化步骤，有时是唯一的净化方法。目前国外已有不少商品的IAC柱出售。这种小柱将能与目标分析物结合的抗体先固化在柱体上，经处理的样品上柱后，单组分BAA或多组分BAA与抗体结合保留在柱上，再经适当溶剂进行洗脱，达到较好的净化效果。

自Hassnoot等首次使用IAC净化组织及尿液中的克伦特罗以来，其在BAA净化中的作用逐渐被得到证实。Jose等通过比较C18和IAC两种净化柱，用HPLC法检测鼠组织中的沙丁胺醇，发现IAC的净化效果更好，回收率为64.3%，检测限为0.1μg/kg。Lawrence等将样品提取液用弱阳离子交换SPE柱与IAC柱联用进行净化，用2%的氨水-乙醇溶液洗脱克伦特罗，采用HPLC直接测定，检测限达0.3μg/kg。IAC柱重复使用10次后未发现柱容量降低；与传统的SPE柱相比，利用抗原与抗体结合机制进行净化的免疫亲和柱具有很好的选择性，净化效果好，可重复多次使用。Shelver等用RAC-IAC柱来净化牛肉、肝脏和肾脏中14C标记的莱克多巴胺以及莱克多巴胺葡萄糖醛酸轭合物，用甘氨酸缓冲液对分析物进行洗脱，IAC柱可重复利用20次。Regiart等用氨基化的磁性微球作为载体，与克伦特罗抗体进行偶联制备了IAC柱，对牛毛发中的克伦特罗进行了特异性吸附。但是IAC柱需要消耗大量的纯化抗体，价格昂贵，分析成本较高，其在BAA净化中的应用受到限制。

6.1.3.4 基质固相分散（MSPD）

Barker等在1989年提出了MSPD，该技术使样品与反向键合硅胶结合后均匀分散于固定相颗粒表面，是一种提取与净化相结合的方式，能够简化处理过程。MSPD是基于C18填料键合相的疏水亲脂作用及其颗粒的机械分散效应设计的，其基本操作是将试样直接与适量的固体基质（硅胶、Florisil、C18、C8等基质填料）研磨，混匀成半固态，装柱，选择合适的溶剂淋洗。MSPD将样品的提取和净化一步完成，避免了样品匀化、转溶、乳化、浓缩造成的待测组分的损失，适用于各种分子结构和极性药物残留的提取净化。Horne等采用此项技术提取牛肝样品中的克伦特罗残留，将0.5g匀浆的牛肝样品与2g C18填料混合并研磨均匀，装柱，用8mL正己烷-乙醚（60∶40，V/V）淋洗，以8mL甲醇洗脱克伦特罗，浓缩至干后以醋酸缓冲液复溶，用放射免疫法测定。Boyd等建立了肝组织中克伦特罗的MSPD净化方法，能检测到0.5ng/g水平以下的克伦特罗。Horne等建立了MSPD结合C18填料净化牛肝脏中的克伦特罗的方法，用放射免疫法进行检测。Du等建立了利用多壁碳纳米管固相萃取技术同时检测10种兴奋剂的LC-MS/MS方法，该方法以多壁碳纳米管作为净化材料，采用分散固相萃取的方式对猪尿样品中的10种药物进行了净化，并对样品的pH、萃取时间、碳纳米管的型号和数量以及洗脱溶液进行了较为详细的考察，优化的条件为：将猪尿样品pH调至10.0，加入20mg外径30~50nm、长度10~30μm的多壁碳纳米管混匀，加入0.5%甲酸的甲醇水溶液（9∶1，V/V）进行洗脱后，用LC-MS/MS进行检测。

6.1.3.5 分子印迹技术（MIT）

MIT使用分子印迹聚合物（MIPs）作为固定相，对目标分子具有特定识别能力。王培龙等对猪尿液中的克伦特罗采用MIPSPE小柱提取、净化，衍生化后进行LC-MS检测，检出限为0.51μg/L，定量限为1.00μg/L，回收率为71.0%~89.3%。Crescenzi等将MIP SPE与MSPD结合起来，净化牛肝脏中的克伦特罗，进行HPLC-ECD或者LC-MS检测，其中LC-MS法的检测限低于0.1μg/kg。Zhao等制备了一种检测克伦特罗的基于纳米银聚合物的分子印迹膜，同时还将该方法的检测结果与LC-MS/MS方法进行了比较，以10ng/g浓度添加时，回收率分别为92.9%~99.3%和94.1%~98.4%。梁荣宁等建立了快速检测猪尿液中的克伦特罗分子印迹电位型传感器，以盐酸克伦特罗为模板，采用沉淀聚合法合成了克伦特罗的MIP，并以其为离子载体，制得MIP膜克伦特罗离子选择性电极。在最优试验条件下，电极对克伦特罗阳离子的检出限可达7.0×10－8mol/L。Qiao等利用MIP作为MIT的填料对鸡肉样品中的克伦特罗进行了净化，并用HPLC-UV进行了检测；该方法将1.0mmol叔丁基胺、1.0mmol邻氯苯胺、4.0mmol甲基丙烯酸、25.0mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和120mg偶氮二异丁腈用15mL氯仿溶解后，超声反应3min后，在缓慢氮气流条件下，将溶液逐滴加到60mL含1.5g聚乙烯吡咯烷酮的水溶液中，60℃聚合反应24h，将聚合物溶液过045μm滤膜，依次用甲醇-乙酸溶液（9∶1，V/V）和甲醇洗去多余的模板及功能单体，40℃真空干燥。该方法尝试以邻氯苯胺和叔丁基胺为模板，模板-功能单体-交联剂的比例为2∶4∶25时，获得最佳聚合反应。

6.1.3.6 QuEChERS方法

QuEChERS是近年来国际上新发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术，由美国农业部Anastassiades教授等于2003年开发。该方法具有回收率高、结果准确、样品处理量大等优点，从而减少了试剂的消耗和试验人员与有毒溶剂的接触，可有效地将提取、分配、净化有机结合，进一步减少提取步骤，提高提取效率。郑玲等将饲料样品加水分散后经4%氨水-乙腈提取，加入25mg C18填料和50mgN-丙基乙二胺（PSA）吸附剂，分散固相萃取净化后，以HPLC-MS/MS进行检测，平均回收率为78.4%~107.1%，相对标准偏差小于12.3%，方法的定量限为0.05mg/kg。

6.1.3.7超临界流体萃取（SFE）

SFE的萃取速度比一般溶剂要快得多，因溶质分子在超临界流体中的扩散系数比在液体中大得多，而且表面张力小，比较容易进入样品中。在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把不同极性、不同沸点和不同分子量的成分依次萃取出来。目前研究较多的超临界流体是二氧化碳，其因具有无毒、不燃烧、对大部分物质不反应、价廉等优点，最为常用。Mandy等采用SFE提取牛肝中的克伦特罗和沙丁胺醇，进行ELISA测定。ÓKeeffe等对牛肝脏进行酶解后，采用SFE提取克伦特罗和沙丁胺醇残留，回收率较高，相对标准偏差小于15%。

6.1.3.8 加速溶剂萃取

一些新的样品处理技术也被用于BAA残留的提取。Fented等用双相渗析分离技术提取肝脏和牛毛发中的克伦特罗残留，该研究采用长25cm、离子交换面积为196cm2的渗析管，将预先湿润的装有提取溶剂叔丁基甲醚、二氯甲烷的渗析管置入匀浆后的组织样品中，在37℃下以150min的转速转动，连续渗析提取4h，然后将渗析管中的溶液转入分液漏斗中，弃去水相，有机相经无水硫酸钠脱水后以氮气浓缩至干，衍生后进行GC-MS测定。该提取方法集提取和净化于一体，简便快速，提取效率高。

6.2 检测方法

6.2.1 HPLC法

HPLC通过流动相和固定相对化合物不同的保留能力而对BAA和杂质进行分离，各组分按一定次序流出后进入柱后检测器，从而实现各组分的分离与检测，是一种经典的定量的分析方法。HPLC法采用反相色谱柱检测BAA，如C18分析柱，以缓冲溶液和乙腈作为流动相，等溶剂或梯度洗脱。常用的检测器包括紫外检测器（UVD）、荧光检测器（FLD）和二极管阵列检测器（DAD）。申屠芬琴等使用HPLC配备FLD对猪肝脏等组织中莱克多巴胺进行了检测，方法的检测限为1ng/g，定量限为2ng/g。吴银良等使用DAD，建立了猪尿液中盐酸克伦特罗对映异构体残留检测的HPLC方法，检出限为0.3μg/L，回收率为76.3%~91.5%，相对标准偏差小于7%。安洪泽等建立了测定饲料中5种BAA的HPLC法，采用UVP与FLD串联检测，方法的平均回收率为86.7%~103.5%，检出限为20μg/kg，定量限为50μg/kg。Fredy等建立检测牛肝脏中克伦特罗的HPLC-UV法，图7-9为克伦特罗标准品、空白牛肝脏及添加药物的色谱图，以50mmol/L磷酸二氢钠/乙腈（pH3.0，85∶15，V/V）为流动相，C18色谱柱（250mm×46mm，粒径5mm），UVD波长为214nm；在添加浓度为5.24~41.96ng/g范围内，方法的回收率大于82%；检测限和定量限分别为0.20ng/g、0.42ng/g。

6.2.2 LC-MS法

HPLC-MS/MS是一种以LC为分离手段、MS为检测器的现代分析技术，尤其是与MS/MS联用后，更能体现MS检测的灵敏度及专属特性，近年来逐步成为测定BAA的有力工具。吴永宁等利用HPLC-线性离子阱质谱（HPLC-ITMS）测定了肌肉中23种BAA以及5种β-阻断剂，内标法定量，各化合物的回收率为47.3%~123.7%。Zhang等建立了饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和克伦特罗的LC-MS法，检测限和定量限分别为0.01mg/kg和0.05mg/kg。

UPLC-MS/MS的应用已经越来越广泛。Zhang等用UPLC-MS/MS检测动物毛发、组织和饲料中的苯乙醇胺A的含量，检测限分别为0.10~0.26μg/kg，定量限分别为0.20~0.37μg/kg，回收率为95.4%~108.9%。Du等建立了尿液中10种BAA的UPLC-MS/MS检测方法。Vulic等在对猪按照0.51mg/kg剂量连续饲喂莱克多巴胺28d后，用UPLC-MS/MS对猪视网膜中莱克多巴胺的含量进行了检测。

在LC-MS/MS分析中，基质效应的研究逐渐成为残留检测技术研究的热点。基质效应的消除方法主要有：优化仪器分析条件、改善样品前处理条件、使用内标、利用基质添加标准曲线等。

Moragues等通过改变样品净化过程来消除肝脏和尿液中克伦特罗检测中的基质效应，该方法在C18柱净化时除使用水、50%甲醇水溶液洗涤外，还加入5mL正己烷进行洗涤以除去脂溶性杂质，同时样品在上机检测前用叔丁基甲醚进行了LLE，表7-4为几种不同提取方法对克伦特罗等7种药物回收率的变化。

Wang等建立了同时检测饲料中12种药物的UPLC-Q/TOF-MS方法，方法采用脱溶剂气为氮气流量为500L/h，脱溶剂温度350℃，锥孔气为氮气，流量为50L/h，离子源温度100℃，毛细管电压3.0kV，扫描范围100~600m/z，并以溴布特罗为例对药物的准分子离子进行了准确判断，如图7-10所示。

6.2.3 GC-MS法

由于BAA的化学结构中具有羟基和氨基等极性基团，易产生强烈吸附，需要衍生化后才能通过GC分离、MS检测器检测。大多数GC-MS法采用硅烷化方法进行衍生化，常用的硅烷化试剂为三甲基硅烷（TMS）试剂，如N-甲基-N-三甲基硅烷基-三氟乙酰胺（MSTFA）和N，O-双（三甲基硅烷基）-三氟乙酰胺（BSTFA）。Caban等的研究证明，用MSTFA和BSTFA试剂进行衍生化，都能够有效地筛选班布特罗等9种BAA。DiCorcia等建立了尿液中15种BAA的GC-MS法，在保证色谱分离时间的前提下，大大降低了MS分析时间，9min内能完成一个GC循环。Leyssens用GC-MS法对牛尿和牛肝中的8种BAA残留进行了测定，检测限为0.5~5ng/g。如果采用负离子化学电离技术，配合氘代稳定性同位素稀释技术，其灵敏度将会得到更大提高。

6.2.4 毛细管电泳（CE）法

CE或称高效毛细管电泳（HPCE），具有高效、快速、进样体积小和溶剂消耗少等优点，在BAA分析中已显出强大的优势。其缺点是载样量少，而且与MS的联用还不如LC-MS成熟，检测器主要有UVD、安培检测器、电化学检测器。Chen等用CE法检测猪饲料提取液中的克伦特罗和沙丁胺醇，样品前处理较简单，提取试剂为pH 10.5的磷酸氢钠-氢氧化钠缓冲液，45min内完成对目标物的检测，克伦特罗的检测限和定量限分别为0.95μg/mL和3.17μg/mL，沙丁胺醇的分别为1.07g/mL和3.57g/mL，两者的回收率为93.30%~104.33%。

6.2.5 免疫分析法

免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。免疫反应涉及抗原与抗体分子间的立体化学、电荷、氢键和偶极间的综合作用，因而具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和很高的灵敏度，非常适用于复杂基质中痕量组分的分析，如动物组织中兽药残留的分析。免疫分析法操作快速，具有较高的灵敏度，一些样品如尿液和血浆等可以直接测定，主要用于BAA的快速筛选检测。

6.2.5.1 ELISA法

竞争性ELISA是目前BAA检测最为常用的方法。Adam等对牛尿样品中的福莫特罗和莱克多巴胺建了多克隆ELISA法，莱克多巴胺与福莫特罗的交叉反应率为20%，虽可用于莱克多巴胺检测，但方法灵敏度低，且和HPLC、GC-MS检测方法的相关性差。Shen等将自制的ELISA试剂盒与商品试剂盒进行对比，并进行GC-MS确证，对猪肉和饲料中添加的沙丁胺醇进行测定，发现两种试剂盒的灵敏率分别为85.3%和100%，专属性分别达到95.2%和90.9%，并且自制的试剂盒未出现假阴性的情况。张军平等以莱克多巴胺单克隆抗体建立了ELISA检测方法，检测限达到0.25μg/g，与HPLC相关性存在差异。Weilin研制的ELISA试剂盒IC50为5.1ng/mL，检测范围0.5~20ng/mL，与HPLC法进行比较，具有很好的相关性。Liu等建立一种检测猪肝中莱克多巴胺的高灵敏度的间接竞争免疫检测方法，方法主要选择了一种高特异性和高敏感性的新型免疫传感器———表面等离子体共振（SPR）传感器作为载体，检测灵敏度可达0.12ng/g。

6.2.5.2 免疫传感器法

免疫传感器法是一种稳定、灵敏、重复性好的检测方法。其基本原理是将免疫测定法与传感技术相结合而构建一类新型生物传感器，利用抗原、抗体特异性吸附反应的性质，将抗原或抗体固定在传感器基体上，通过传感技术使抗原与抗体反应时产生的物理、化学、电学或光学上的变化转变成可检测的信号来测定待测分子的浓度。该传感器可分为非标记型和标记型两类。免疫传感器法的关键步骤是抗原、抗体的制备和抗原或抗体的固定。

Shelver等建立了用免疫传感器检测RCT残留的方法，并与HPLC、ELISA试剂盒进行了对比试验，该法检测IC50为（4.7±0.21）ng/mL，回收率为100%~110%，变异系数小于10%。对于未水解的尿样，与HPLC的相关系数为0.95；对于经酶水解的尿样，相关系数为0.94。与ELISA试剂盒比较，样品预处理简单，酶水解样品可将RCT代谢产物转变为RCT母体，不仅检测结果准确，还可消除假阴性结果，防止漏检。但该方法由于吸附常数较大，免疫传感器的抗原与抗体反应不具有可逆性，其灵敏度、稳定性难以满足实际需求，实际应用相对较少。

6.2.5.3 免疫层析法

免疫层析法中发展最成熟的是胶体金免疫层析法，胶体金免疫层析法的基本原理是氯金酸（HAuCl4·3H2O）在还原剂作用下聚合成金颗粒，由于金颗粒之间的静电作用和布朗运动，使其保持水溶胶状态，胶体金富含电子和强大的给电子能力，以非共价键与RCT单克隆抗体结合形成金标抗体（Ab-Au），加入待测样品后，金标抗体重新水化并与样品相互反应，在毛细管的扩散作用下沿着吸水纸方向移动，至检测线时，若样品中不含RCT或含量低于检测限，金标抗体就会与T线上的抗原反应，若样品中含有RCT，RCT与金标抗体反应而占据了金标抗体上的有限位点，金标抗体不再与T线上的完全抗原反应而越过检测线，不出现红色条带，仅在质控线出现红色条带。该方法由于使用简便，不需要借助仪器，不需要专业技术人员，不受检测环境限制，15min内出结果，是一种值得推广的现场及基层单位使用的定性筛选方法。

随着材料科技发展，免疫层析法又有新的发展方向。近几年胶乳免疫层析法在国际上有了初步的进展。其中荧光胶乳是一类新型的功能性载体材料，采用聚苯乙烯或苯乙烯单体在一定条件下，加入特定的荧光信号，将微球的表面乙烯基团酰肼化，引入酰胺基再将此酰胺基羧基化、氨基化合成合格的各类乳胶材料。最后胶乳颗粒与蛋白通过共价结合，形成稳定标记复合物，用于替换免疫层析检测中的胶体金材料。各类胶乳材料替换胶体金材料的优势在于：胶乳和标记物的结合机理是羧基和氨基的化学反应，非常稳定，结合力优于胶体金的表面结合力；胶乳灵敏度可控性高，与胶乳微球表面基团含量、微球粒径相关。灵敏度较胶体金高10~1000倍。Xu等利用二氯化钌-硅纳米颗粒固化沙丁胺醇单克隆抗体，建立了可同时检测沙丁胺醇、西马特罗、特布他林、克伦特罗、溴布特罗5种药物的胶体金试纸条，检测限可达0.43ng/mL，检测试纸条示意图如图7-11所示。