藻毒素高温分解（臭氧对不同基质中呕吐毒素的降解效果研究）

藻毒素高温分解（臭氧对不同基质中呕吐毒素的降解效果研究）1 材料与方法臭氧(Ozone，03)是一种具有极强氧化性和高效杀菌性的气体，将其作为一种化学方法来降解DON已成为一种新兴的、高效的DON降解技术。臭氧能破坏真菌毒素结构中的双键，对产毒真菌具有一定的灭活作用，从而达到降解真菌毒素的目的。此外，臭氧在使用后可自行分解为氧气，无污染残留。 研究表明， 臭氧对谷物、水果和蔬菜中的真菌毒素均具有良好的降解效果， 并且能够改善食品的品质。本实验研究了臭氧对固态DON、DON水溶液、小麦籽粒以及全麦粉中DON的降解效果及降解规律，并通过对比臭氧对以上不同基质中DON的降解效果，研究基质对DON的臭氧降解效果及规律的影响，从而为臭氧在降解小麦中DON的应用提供更广泛和更深人的理论依据。摘要：为了研究臭氧对不同基质中呕吐毒素(DON)的降解效果及其规律，采用臭氧来处理不同状态下DON纯品和赤霉病小麦 并初步探究了小麦组分对臭氧降解DON效果的影响。结果

中国粮油学报 (4)

作者： 刘芳、李萌萌、刘远晓、刘海波、关二旗、卞科

(河南工业大学粮油食品学院，郑州450001)

关键词：臭氧；DON；赤霉病小麦；料液比；组分

摘要：为了研究臭氧对不同基质中呕吐毒素(DON)的降解效果及其规律，采用臭氧来处理不同状态下DON纯品和赤霉病小麦 并初步探究了小麦组分对臭氧降解DON效果的影响。结果表明，臭氧可以在短时间内降解水溶液中的DON纯品和固态DON纯品，在处理浓度为10 mg/L、处理时间为60s时 DON的降解率可达90%；臭氧可以有效降解小麦中的DON，料液比对小麦中DON的降解效果具有显著影响，当小麦粉与水的料液比为1:6时，臭氧可将初始含量为1. 82 mg/kg的全麦粉中DON含量降解至国家标准限量(1 mg/kg) 以下。此外，在臭氧降解小麦中的DON时，小麦麸皮、 淀粉和蛋白均对其降解效果有着明显的阻碍作用， 且蛋白的阻碍作用最大。由此可知，臭氧可以显著降解不同状态下的DON纯品 对小麦各组分中的DON有较好的降解效果，并且臭氧对DON纯品的降解效率要显著高于赤霉病小麦，说明小麦各组分对臭氧降解DON有一定影响，其中蛋白的影响效果最为明显。不同基质中的DON的臭氧降解效果不同，且该降解效果受臭氧处理浓度和处理时间、样品与臭氧接触面积、祥品水分含量等因素的影响。

小麦赤霉病( Fusarium head blight FHB)是由镰刀菌属真菌引起的一种病害，赤霉病侵染小麦后，不仅会降低小麦产量，而且会导致小麦中蛋白质和面筋含量降低、研磨出粉率降低、面制品的颜色加深，进而影响小麦的理化特性及食用品质。此外，镰刀菌侵染小麦后在生长和贮藏过程中会产生多种真菌毒素。其中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇( deoxynivalenol，DON)是由禾谷镰刀菌产生的最主要的一种单端孢霉烯族化合物，是小麦中检出率最高、危害最严重的真菌毒素之一。DON可以与核糖体结合，抑制蛋白质RNA和DNA的合成，并诱导细胞凋亡，当人和动物摄入DON(超出国家限量标准1 mg/kg) 时，会产生呕吐、腹泻、厌食、恶心、神经紊乱等中毒反应。长期摄人DON，即使是在较低浓度下，也会损害人和动物的健康，摄人过多时可能使造血系统受到损害从而导致死亡。

食品中真菌毒素的防控可分为产前预防和产后削减两个途径。产前预防即在谷物收获前进行 通常使用杀真菌剂和生物防治剂来进行杀菌，或者在谷物中植入外源性基因以增强谷物的抗逆性。真菌毒素的预防过程可能受到多种因素的影响，例如谷物品种、播种时间、培育技术以及储藏方法等，这些因素都会影响谷物中真菌毒素的产生和分布。产后削减方法可分为物理消减、化学降解和生物降解三类，其中物理消减方法主要包括吸附、挤压蒸煮、热处理、辐照等；化学降解一般是使用化学制剂脱毒，如碳酸钠、石灰水、氯气、氨气以及臭氧等气体或水溶液；生物降解可通过微生物代谢、发酵、添加酶制剂等方法来实现对真菌毒素的降解。

臭氧(Ozone，03)是一种具有极强氧化性和高效杀菌性的气体，将其作为一种化学方法来降解DON已成为一种新兴的、高效的DON降解技术。臭氧能破坏真菌毒素结构中的双键，对产毒真菌具有一定的灭活作用，从而达到降解真菌毒素的目的。此外，臭氧在使用后可自行分解为氧气，无污染残留。 研究表明， 臭氧对谷物、水果和蔬菜中的真菌毒素均具有良好的降解效果， 并且能够改善食品的品质。本实验研究了臭氧对固态DON、DON水溶液、小麦籽粒以及全麦粉中DON的降解效果及降解规律，并通过对比臭氧对以上不同基质中DON的降解效果，研究基质对DON的臭氧降解效果及规律的影响，从而为臭氧在降解小麦中DON的应用提供更广泛和更深人的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赤霉病小麦：取3种染病程度不同的赤霉病小麦，初始DON含量分别为1.27、2.82、5.66 mg/kg，初始含水量分别为13. 14%、11. 61%、11. 20% ，编号依次为：L、M、H；郑麦103；DON标品(纯度≥99% )；乙腈(色谱级);乙腈(分析级)；水(电阻率≥18.2MQ，TOC≤4 μg/L)。

1.2 仪器与设备

COM—AD—01臭氧发生装置，JSA9紫外臭氧检测器，FW—80高速万能粉碎机，MLU-202布勒磨粉机，HJ—6A恒温磁力搅拌器，12165001B多功能净化柱，MTN—2800D氮吹浓缩仪，5810R高速离心机，Freezone6plus真空冷冻干燥机，e2695高效液相色谱仪。

1.3 实验方法

1.3.1 臭氧处理

开启臭氧发生器和紫外臭氧检测器，预热30min以上，直至检测器读数稳定，然后调零。设定臭氧浓度，称取待测样品 将其置于样品反应瓶中进行处理。处理过程中，每隔20min晃动样品反应瓶，以保证臭氧与样品充分均匀反应。

1.3.2 臭氧处理DON纯品

用色谱级乙腈将1.0 mgDON标准品完全溶解，并定容至10mL 得到100μg/mL的DON标准储备液。取适量标准储备液，稀释至10 μg/mL 取0.3mL该溶液 用高纯氮气吹干，得到3 μg的溶质 将该溶质直接进行臭氧处理，研究臭氧对固态DON的降解效果;此外 取0.3 mL溶液 用高纯氮气吹干后，将其溶质溶于1 mL的水溶液，得到3 μg/mL的DON水溶液，然后进行臭氧处理，研究臭氧对水溶液中DON的降解效果;臭氧处理浓度分别设置为0、2、4、6 8、10 mg/L 臭氧处理时间分别设置为0、10、30、60、120、240 S。

1.3.3 臭氧处理赤霉病小麦

取赤霉病小麦籽粒，参照GB/T 5009. 3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》测定小麦含水量。将部分小麦籽粒除杂后用万能粉碎机粉碎，粉碎后物料过40目筛 得到全麦粉，分别将这3种小麦籽粒和全麦粉按照1.3. 1中步骤进行臭氧处理;另取部分M小麦籽粒，参照NY/T 1094. 1—2006《小麦实验制粉第1部分:设备、样品制备和润麦》调节小麦含水量至15%，并参照NY/T 1094. 2—2006《小麦实验制粉第2部分：布勒氏法用于硬麦》 采用布勒磨粉机进行研磨制粉，通过以上步骤分别得到调质后的小麦籽粒、调质后的全麦粉、小麦粉以及麸皮，然后通人臭氧进行处理，以上臭氧处理浓度分别设置为0、20、40、60、80 mg/L 处理时间均为60min。

1.3.4 料液比对DON的臭氧降解效果的影响

取H小麦籽粒及其全麦粉，分别按照料液比为1:1、1:2、1:4、1:6加入水 然后通人臭氧气体进行处理 臭氧处理质量浓度分别设置为0、20、40、60、80mg/L，处理时间均为60 min。将经臭氧处理后的小麦籽粒和全麦粉置于高速离心机中以4000 r/min离心10 min 然后倒掉上清液 在-20 °C冰箱中预冻24h后 冷冻干燥48 h，取出后用粉碎机打粉，测定其中DON的含量。

1.3.5 小麦组分对臭氧降解DON效果的影响

取未染病小麦(郑麦103)磨粉，得到麸皮和面粉；将面粉通过水洗法得到小麦淀粉和面筋蛋白。分别称取等量的蛋白质、淀粉和麸皮样品(未加人组分的样品作为对照组)，加入一定浓度的DON溶液，待各试管中样品混匀后，将其放于4 °C冰箱低温避光保存过夜，以保证各组分与DON反应充分；将以上混合液置于臭氧反应装置中处理，每个样品的反应时间为60 s，臭氧质量浓度分别设定为0、2、46、8 mg/L，处理完成后，置于4 °C冰箱中过夜，以保证臭氧和各组分充分反应；待该混合液反应完全，测定其样品液中DON总溶质含量。

1.3.6 DON的测定

DON的提取、净化、检测及DON标准溶液的配制参照李萌萌、刘远晓等的研究并稍作改动，具体操作步骤如下；

DON的提取：准确称取25 g样品置于250 mL烧杯中，加人100 mL提取液(乙腈/水=84: 16) 然后置于磁力搅拌器上搅拌20 min 静置5 min。

DON的净化：吸取5 mL静置后的上清液过DON多功能净化柱 准确收取滤液4 mL于具塞试管中，低温下氮吹吹干，用流动相(乙腈/水=16:84)复溶后置于高速离心机中以12 000 r/min离心5 min 然后过0.22 um有机滤膜，4 °C保存备用。

DON的检测：使用高效液相色谱对DON进行检测。色谱条件：色谱柱，C18反相色谱柱，4. 6mm X250 mm，填料粒径5 μm；流动相，乙腈/水= 16:84；流速，0.6 mL/min；进样量，10 μL；检测方法，紫外检测 波长218 nm。

DON标准溶液的配制：取1mLDON储备液低温下氮吹吹干，使用流动相配制成质量浓度为0.1、0.20.5、1、2、5、10 mg/L的标准工作液，经0.22 μum有机滤膜过滤，4°C保存备用。

DON降解率的计算：DON降解率=(1 -CA/CO，)x 100%

式中：CA为样品经不同方式处理后DON质量浓度/mg/ kg；Co为样品中DON的初始质量浓度mg/kg。

1.3.7 数据分析

所有实验均进行至少3次平行实验，采用Excel2010进行数据的统计与前期处理，采用SPSS 20进行方差分析，多重比较采用Duncan式。

2 结果与分析

2.1 臭氧对DON纯品降解效果的影响

2.1.1 臭氧处理浓度对DON水溶液和固态状DON的降解效果

由图1可知，臭氧不仅可以显著降解DON水溶液，还可以降解固态状DON，且在相同的处理时间条件下，其降解率均随着臭氧处理浓度的增加而显著升高。在臭氧质量浓度为2 mg/L 时，二者的DON降解率可达45%左右，在臭氧质量浓度为10mg/L时，DON降解率可达90%左右。与降解固态DON相比 水溶液中DON的降解率相对较高，当臭氧质量浓度同为6 mg/L、处理时间为60 s时，臭氧对水溶液中DON的降解率可达83%，而对固态DON的降解率为60%左右，这可能是由于水的存在而导致的。有研究表明，臭氧氧化过程中，水的存在会影响DON的降解，它与DON的降解率呈正相关。臭氧分子可溶解进人水中后形成 . 0H等自由基，再通过自由基降解DON， . 0H自由基氧化能力比臭氧分子更强，进而提高了臭氧对DON的降解效果。

2.1.2 臭氧处理时间对DON水溶液和固态状DON的降解效果

由图1可知，在臭氧处理浓度不变时，DON水溶：液和固态状DON的降解率均随着臭氧处理时间的增加显著升高。当臭氧质量浓度为6 mg/L、处理时间为10s时，水溶液中DON的降解率即可达到69. 15%， 固态状DON能达到60%左右;这表明，臭氧在短时间内即可对不同状态下的DON纯品产生良好的降解效果。有研究表明，使用质量浓度为8mg/L的气态臭氧处理质量浓度为2 μg/mL的DON水溶液，在15s内DON降解率即可达到95. 68%。DON对臭氧较敏感，较低浓度的臭氧即可对DON产生较好的降解效果。

由图1可知，当臭氧浓度增大到一定程度、处理时间增长至一定值时，DON降解率的增速均呈现变缓的趋势，这可能是因为在臭氧浓度和处理时间达到特定值时，臭氧对DON的降解达到了饱和。臭氧不仅可以在短时间内降解水溶液中的DON纯品，而且可以显著降解固态DON纯品，在采用臭氧降解DON的过程中，臭氧浓度和处理时间是影响DON的臭氧降解效果的两大因素，适当的提高臭氧浓度或增长处理时间，均可显著提高臭氧对DON的降解率。

2.2 臭氧对赤霉病小麦降解效果的影响

由图2、图3可知，臭氧处理可显著降低小麦籽粒和全麦粉中DON的含量，降解率随着臭氧浓度的增加而升高，且全麦粉中DON的降解率高于小麦籽粒。有研究表明，在臭氧质量浓度为60 mg/L的条件下处理120min后，小麦籽粒中DON的降解率为17. 1%，而全麦粉中为26. 4%，这是由于全麦粉与臭氧的接触面积更大，DON能够更彻底地和臭氧发生反应。

可以看出，臭氧对不同含水量的样品中的DON的降解效果不同 M样品在含水量为11.61%、臭氧质量浓度为80 mg/L时，DON的降解率为18. 44%，在润麦后，当含水量达到14.3%时，降解率可达27.62%。由此可见，小麦的含水量对小麦中DON的臭氧降解效果有一定影响，含水量高的样品中DON降解率较高。有研究表明，初始含水量为16%的小麦籽粒经过臭氧处理后，DON的降解率比相同条件下臭氧处理初始含水量为11. 3%的小麦籽粒高17%左右，含水量为20. 10%的小麦粉中DON的降解率显著高于含水量分别为16. 29%和11. 79%的小麦粉 这与本研究的结果趋势一致。

小麦麸皮中测得DON含量最高，小麦粉中最低，说明DON是从籽粒的外部皮层向内部侵染，因此皮层DON含量最高，中心胚乳含量较少。由图3可知，在相同处理条件下，小麦粉和麸皮中DON的降解率比小麦籽粒高，这可能是由于经润麦和制粉后小麦粉和麸皮的含水量增加，或与臭氧接触面积较大，从而使得DON降解率较高。

2.3 料液比对小麦籽粒和全麦粉中DON的臭氧降解效果的影响

从图4可以看出，水分对小麦籽粒和全麦粉中的DON有一-定去除效果，含水量越高 DON去除效果越好，在料液比为1:1时，由于全麦粉加水量少，造成结块严重，故基本不发生DON含量的降低。在加水量不断增加时，小麦籽粒和全麦粉中DON的去除量随着加水量的增加而升高，当料液比为1:6时，小麦籽粒中的DON的去除率接近50%，全麦粉中DON去除率为67%左右，这可能是由于DON大多集中于表面并且易溶于水。

由图5和图6可知，当用臭氧处理不同料液比的小麦籽粒和全麦粉时，DON的降解效果随着料液比的增大而升高，且随着臭氧质量浓度的增加也呈现升高的趋势，在料液比为1:6时，经过质量浓度为80mg/L的臭氧处理60 min 后，小麦籽粒中DON的降解率可达41%，全麦粉可达45%。有研究用不同料液比的臭氧水降解小麦中的DON 发现随着料液比的增大，以及臭氧水浓度的升高，DON的降解率显著升高 说明了臭氧和 . 0H的量增加，有利于DON的降解，且臭氧水浓度越高，DON与臭氧分子接触越充分，生成的 . OH也越多，因而降解作用越强。

由图5可知，当料液比由1:4变至1:6时，臭氧对小麦籽粒中DON的降解率不再升高，这可能是因为在实验的过程中这两种加水量的液面都能没过籽粒，水与籽粒的接触面积几乎一致，因此，即使加水量增加，DON的降解率变化也不显著。由图6可知，与小麦籽粒不同的是，随着料液比增加到1:6时，臭氧对全麦粉中DON的降解率依旧呈现升高的趋势，这可能是因为全麦粉与水混合后，变成了混合物，加水量越多，全麦粉在臭氧处理过程中与臭氧接触机会越大，因此降解率越高。

2.4 小麦组分对臭氧降解DON效果的影响

由图7可知 未加人组分的DON溶液的降解率远远大于加入3种组分的样品组，这3种样品组中，加人淀粉的样品组中DON的降解率最高，麸皮次之 蛋白最低，且加入淀粉和麸皮的样品组中DON的降解率均随着臭氧浓度的增加而升高 而加入蛋白的样品组的降解率呈现降低的趋势，并呈现负值，这表明臭氧会引起蛋白质多肽主链氧化、肽键断裂以及蛋白质交联等一系列变化，此时，与小麦蛋白发生结合的DON从面筋网络中游离出来，导致样品溶液中的DON含量增加。由此可见 在臭氧降解小麦中的DON时，麸皮、淀粉和蛋白均对其降解效果有着明显的阻碍作用，且蛋白的阻碍作用最大。

3结论

臭氧可以在短时间内显著降解水溶液中的DON和固态DON 且臭氧对这两种状态下的DON纯品的降解率均随着臭氧处理浓度和处理时间的增加而升高;臭氧对全麦粉中DON的降解率显著高于小麦籽粒 对小麦粉和麸皮中DON也具有较好的降解效果 臭氧对接触面积大和水分含量高的样品中的DON的降解效果较好;臭氧对料液比不同的小麦籽粒和全麦粉有不同的降解效果，料液比增大，降解率也随之升高，当加水量液面超过小麦籽粒时，随着加水量的增加，小麦籽粒降解率不再升高，而全麦粉的降解率一直处于升高趋势。本研究还发现，臭氧对DON纯品的降解效果远远高于赤霉病小麦 这其中主要是小麦蛋白对其降解效果起到明显的阻碍作用。

臭氧对不同基质中的DON的降解效果不同，在臭氧降解DON的过程中，可通过适当提高臭氧的处理浓度和处理时间增大臭氧与样品的接触面积、以及在合理范围内提高样品的水分含量，防止样品结块，来提高臭氧对DON的降解效果。此外，小麦组分对臭氧降解DON有明显的阻碍作用，因此，在未来的研究中，应着重于小麦组分对臭氧降解DON的影响规律及其机理方面的研究，为DON的臭氧降解技术的改进提供参考。