吸附活性位点的表征（JAgricFood）

吸附活性位点的表征（JAgricFood）突变对催化效率的影响通过定点突变，Gln38、Ile39和Cys43分别被Tyr和Trp、Met、Asn和Ser取代。将含有酶突变基因的重组质粒转化K.phaffiiGS115，突变体分别进行表达。获得了C43N、C43S、I39M、Q38Y和Q38W5个突变体，它们的活性分别为106.8、73.5、80.8、151.0和67.0 U/mL。Q38Y的活性最高，是WT的2.0倍。这些结果表明，5个突变体均在K.phaffiiGS115中成功表达，突变体的表达没有受到突变的抑制。经纯化后，突变株C43N、C43S、I39M、Q38Y和Q38W的比活分别为15671.2、545.4、682.0、497.9和823.3 U/mg(图2A)。与WT相比，突变株C43N的比活显著提高，比活(2284.9 U/mg)提高了6.9倍。作者的研究首次表明，催化口袋中的43位残基对FruSG的活性很重要，而

今天推送的文章发表在J Agric Food Chem.上的“Significant Improvement of Both Catalytic Efficiency and Stability of Fructosyltransferase from Aspergillusnigerby Structure-Guided Engineering of Key Residues in the Conserved Sequence of the Catalytic Domain”，作者为江南大学生物工程学院的陈献忠教授。

果糖基转移酶（FTase，EC:2.4.1.9）由于其在益生元低聚果糖（FOS）生产中的应用而引起越来越多的关注。FOS是代表性的益生元，对改善人类肠道微生物平衡和个人健康具有重要意义。由于FTase具有转果糖化活性，因此广泛用于FOS的工业生产。已从细菌、真菌和植物中分离出FTase。来自微生物的FTase已被广泛应用于低聚果糖的工业过程。天然酶作为生物催化剂具有一定的局限性(如催化效率低、稳定性差等)。酶的固定化和包埋可以提高酶的重复利用率和生化稳定性，但只能在一定程度上提高酶的催化性能。优化了在K.phaffii中表达的重组FTase的固定化条件，在此条件下固定化的FTase活力降至原来的20%。

定点突变技术是常用策略之一，可用于通过改变其结构来提高天然酶的催化性能，从而加深对酶功能与结构之间关系的理解。在作者之前的工作中，作者成功地在K.phaffii中表达了黑曲霉SG610的FruSG，并对重组FruSG进行了鉴定。本研究作者以Aspergillus kawachii β-FTase的晶体结构(PDB码：5XHA)为模板，构建了黑曲霉SG610的FruSG模型。根据序列比对和结构分析对活性部位口袋周围的不同区域进行分析，发现其中一个主要的区别是叶片I的第一个β链围绕着亲核残基Asp，这可能对FruSG的催化效率具有潜在的关键作用。然后，根据主要差异，进行理性设计，探索该残基的功能，提高FruSG的催化效率，使该FruSG成为一种优良的工业酶。

基于结构分析的突变位点筛选

本研究作者首次利用蛋白质工程方法在结构分析的基础上提高FTase的催化效率和稳定性。以A.kawachiiβ-FTase(PDB代码：5XHA)的晶体结构为基础，用Schrödinger软件构建了A.nigerFruSG的三维模型(图1A)。FruSG的结构包含两个结构域：C-端β-夹心结构域和N-端催化结构域。N-末端催化结构域包括一个五叶β-螺旋桨折叠。活性中心控制末端果糖的结合和催化反应，其中FruSG为Asp41、Asp171和Glu273分别用于亲核剂、过渡态稳定剂和通用酸碱催化剂(图1B/C)。

通过DNAMAN软件对几个选定的GH32 FruSGs的N-末端β-螺旋桨结构域进行了比对。不同FruSGs的比对序列与GenBank登录号相关联。用于底物识别的几个必需残基在所有GH32成员中都是保守的，而其他残基在真菌FruSGs中是保守的。在序列比对和结构分析中，确定了活性部位口袋周围的不同区域，主要区别之一是叶片I的第一条β链位于亲核残基Asp周围(图1B/C)。FruSG中³⁸QIGDPC基序在曲霉FruSGs、尖孢镰刀菌FO47β-呋喃果糖苷酶和Diaporthe ampelina胞外转化酶中保守。Asp41作为活性位点之一，是一个保守残基；Pro65靠近活性位点Asp41也是一个保守残基(图S1)。因此，Asp41和Pro65不能被其他氨基酸取代，因为这种替代可能会导致FruSG活性的丧失。在上述分析的基础上，确定并选择了FruSG中³⁸QIGDPC基序的Gln38、Ile39和Cys43(图1C)。Gln38分别被Tyr和Trp取代；Ile39被Met取代；Cys43分别被Asn和Ser取代。

突变蛋白的表达和纯化

通过定点突变，Gln38、Ile39和Cys43分别被Tyr和Trp、Met、Asn和Ser取代。将含有酶突变基因的重组质粒转化K.phaffiiGS115，突变体分别进行表达。获得了C43N、C43S、I39M、Q38Y和Q38W5个突变体，它们的活性分别为106.8、73.5、80.8、151.0和67.0 U/mL。Q38Y的活性最高，是WT的2.0倍。这些结果表明，5个突变体均在K.phaffiiGS115中成功表达，突变体的表达没有受到突变的抑制。经纯化后，突变株C43N、C43S、I39M、Q38Y和Q38W的比活分别为15671.2、545.4、682.0、497.9和823.3 U/mg(图2A)。与WT相比，突变株C43N的比活显著提高，比活(2284.9 U/mg)提高了6.9倍。作者的研究首次表明，催化口袋中的43位残基对FruSG的活性很重要，而Asn取代Cys43可以显著提高FruSG的比活(图2B/C)。

突变对催化效率的影响

对以蔗糖为底物的突变体的动力学参数进行了测定和比较，如表1所示。C43N、C43S、I39M、Q38Y和Q38W的K_m值分别为130.1、297.6、263.4、199.3和232.9 g/L。WT的K_m值为214.1 g/L，不同菌株的野生型FTase的K_m值通常较高。例如，Aspergillus aculeatus野生型FTase的K_m值为645.8 g/L。C43N和Q38Y的K_m值比WT有所降低。C43N的K_m值仅为WT的60.8%，说明突变体C43N与底物(蔗糖)的亲和力显著增强。同时，与WT相比，C43N、C43S、I39M、Q38Y和Q38W的催化效率常数(k_cat)均有所提高。这表明活性中心Asp41周围的残基Cys43、Ile39和Gln38对FruSG的催化效率是重要的。其中，C43N的k_cat是WT的21.2倍。C43N的k_cat为1403.0 s⁻¹，而WT仅为63.3 s⁻¹。C43N的k_cat/K_m值也显著增加，是WT的36倍。同时，与WT相比，C43N可以有效地合成FOS。在本工作中，与WT相比，首次采用蛋白质工程方法显著提高了FTase的催化效率。这表明突变株C43N具有较高的催化效率，在FOS的工业化生产中具有应用潜力。

残基位点Cys43对FruSG的催化效率最重要。为了进一步验证残基位点Cys43对催化效率的重要性，根据所选GH32 FruSGs之间的比对，选择Cys43附近的Lys44并分别替换为Ala、Gly和Met。与WT相比，突变体L44A和L44G的催化效率显着提高。突变体L44A和L44G的k_cat值分别比WT高6.6倍和2.6倍，表明Cys43附近的残基位点44对于提高FruSG的催化效率也很重要。推测³⁸QIGDPC基序的残基位点Cys43对于提高FruSGs的催化效率至关重要。

分析C43N催化效率的提高

将WT氨基酸序列的Cys43替换为Asn用于构建3D模型。构建了C43N的3D模型，并将底物（蔗糖）分别对接到WT及其C43N突变体的结合位点。Glide计算的C43N与底物的对接分数为-5.980 kcal/mol，低于WT的对接分数（-4.887 kcal/mol）。这表明与WT相比，C43N和底物之间的亲和力增加。这应该是C43N催化效率显着高于WT的主要原因之一。

Asp41不能被其他氨基酸取代，其替代可能导致FruSG活性的丧失。位于活性中心Asp41附近的Cys43可能对该基序区域具有重要意义。羟基Cys-62(在结构上相当于FruSG中的Cys43)取代含有Asn的化合物可能会改变该区域活性中心口袋的形状。还发现该基序上的氨基酸替换可能改变了环境，产生了亲核残基的倾斜，这可能改变了-1和 1亚基的取向。突变体C43N的构象和Asp41周围的环境可能是催化效率提高的主要原因之一。

为了确定蔗糖与活性中心周围残基的相互作用，对蔗糖−WT和蔗糖−C43N络合物进行了50 ns MD模拟。计算了MD模拟过程中蔗糖与周围残基之间形成的氢键。对于C43N和WT，蔗糖与周围的六个残基形成氢键。突变体C43N中蔗糖与周围残基之间形成的持久氢键可能是该酶对底物亲和力较强的原因。K_m值低的酶对底物具有较高的亲和力，突变株C43N的K_m值(130.1 g/L)低于WT(214 g/L)(表1)，该酶对C43N底物的亲和力较强可能是其K_m值较低的原因之一。

另一方面，作者用PROPKA分别计算了WT和突变体C43N的极性氨基酸的pK_a值(图3)。突变体C43N活性中心的几个关键残基如D197和E273的pK_a值低于WT，而Asp41没有明显变化。此外，突变体C43N活性中心周围其他残基的pK_a值也低于WT。作者推测，由于Glu273被推荐用于通用的酸碱催化剂，突变体C43N的Glu273具有较低的pK_a值，这可能导致更容易催化。同时，由于Asp171作为过渡态稳定剂的提出，较低的pK_a值可能会更好地稳定过渡态。

C43N的热稳定性和pH稳定性

测定和分析了C43N的热稳定性和pH稳定性(图4)。C43N的最适温度与WT相同(图4A)。C43N的最适温度为50 ℃，说明用ASN取代Cys43后，FruSG的最适温度没有改变。与WT相比，C43N的热稳定性有所提高(图4B)。当温度从30 ℃升高到50 ℃时，WT的活性迅速丧失，在45 ℃的Mcllvaine缓冲液(100 mmol/L，pH 5.5)中孵育2 h后，C43N的初始酶活保留了86.6%，而WT仅保留了60.0%。C43N在50 ℃的Mcllvaine缓冲液(100 mmol/L，pH 5.5)中孵育2 h后，C43N的初始酶活保持了37.0%，而WT活性完全丧失。结果表明，该突变提高了FruSG的热稳定性。Aspergillus sojaeFFase在40 ℃下稳定，Penicillium oxalicumFTase在较宽的温度范围内(25-55 ℃)表现出较高的活力，这表明其在FOS的商业生产中具有潜在的应用前景。

如图4所示，测定并分析了C43N的最适pH和pH稳定性。C43N的最适pH从5.5提高到6.0，在pH为9.0时，C43N保持了约70%的活性，而WT的活性急剧下降(图4C)，表明突变的C43N具有比WT更宽的pH范围。如图4D所示，与WT相比，C43N的pH稳定范围变得更宽。在pH为4.0-9.0的范围内，C43N的初始活性达到90%以上。但在pH为4.0-9.0范围内，WT的稳定性较差。例如，在pH为4.0、温度为4 ℃的条件下孵育24 h后，WT的初始活性为83.2%，在pH为9.0、温度为4 ℃的条件下孵育24 h后，WT的活性迅速下降，仅保持其初始活性的76.6%。突变(用Asn取代Cys43)提高了FruSG的pH稳定性。

分析C43N增强的热稳定性

酶的RMSD反映了MD模拟过程中骨架的稳定性。在本研究中，在325 K下进行了50 ns的分子动力学模拟，以分析WT和突变体C43N的结构特性。WT和突变体C43N的RMSD值都在1到2.0 Å之间，这是球状蛋白的典型值(图5A)。在MD模拟的中后期，突变体C43N的RMSD趋于稳定，平均RMSD低于WT，表明突变体C43N具有更稳定的蛋白质骨架。

RMSF反映了酶的每个氨基酸运动的可能性，氨基酸的RMSF值越高，表明残基具有更高的自由度。对WT和突变体C43N在325 K下的RMSF图分析表明，该突变体的大多数部分是相似的(图5B)。可以观察到，WT的平均RMSF(0.817)高于C43N的平均RMSF(0.803)。对于残基50−100和275−300，WT和突变体C43N之间可以观察到显著的差异。此外，N43的RMSF值(0.513)低于C43的均方根值(0.616)。基于上述分析，残基43的RMSF值较低，局部和总体RMSF值的降低可能会导致C43N稳定性的提高。

整理：孙骁

文章信息：

DOI：10.1021/acs.jafc.2c01699

文章链接：https://doi.org/10.1021/acs.jafc.2c01699