质粒dna的提取与鉴定实验结果分析（质粒DNA的分离纯化和鉴定）

质粒dna的提取与鉴定实验结果分析（质粒DNA的分离纯化和鉴定）“苏研院质粒基因库” 的建立与当下中国企业及科研单位对于质粒资源在保藏及使用方面的巨大需求高度契合，一经发起就得到来自于国内不同研究科研机构、高等院校、临床医疗机构等科研专家与学术权威的积极响应。该平台将以完善的资源收集与保藏制度、强大的数据库管理系统和专业科学的分发流程，确保质粒资源库的高效有序运行，打造高水平的资源共享平台，满足各实验室在质粒资源上的需求，进而推动我国生命科学研究工作的发展。

　　在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA 为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化 常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
　　（一）、碱法
　　1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟 弃上清 将离心管倒置使上清液全部流尽。
　　2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。
　　3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。
　　4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中 充分悬浮菌体细胞。
　　5、加入12ml新配制的溶液II 盖紧瓶盖 缓缓地颠倒离心管数次 以充分混匀内容物 冰浴10分钟。
　　6、加9ml用冰预冷的溶液III 摇动离心管数次以混匀内容物 冰上放置15分钟 此时应形成白色絮状沉淀。
　　7、4℃下5000g离心15分钟。
　　8、取上清液 加入50ml RNA酶A(10mg/ml) 37℃水浴20分钟。
　　9、加入等体积的饱和酚/氯仿 振荡混匀 4℃下12000g离心10分钟。
　　10、取上层水相 加入等体积氯仿 振荡混匀 4℃下12000g离心10分钟。
　　11、取上层水相 加入1/5体积的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000) 冰上放置60分钟。
　　12、4℃下12000g离心15分钟 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤，4℃下12000g离心5分钟。
　　13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。
　　[注意] 1. 提取过程中应尽量保持低温。
　　2. 加入溶液II和溶液III后操作应混和 切忌剧烈振荡。
　　3. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶 利用RNA酶耐热的特性 使用时应先对该酶液进行热处理(80℃1小时) 使DNA酶失活。

　　（三）、Sephrose 2B柱纯化质粒DNA
　　碱法提取的质粒DNA即使用RNA酶处理 仍会含有少量RNA。当有些试验需无RNA污染的DNA制品时 则需进行进一步纯化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B进行纯化 该方法具有快速 条件温和 重复性好 载体物质可以再利用等优点 因而已广泛用于质粒DNA纯化。
　　1、将Sepharose 2B经含0.1% SDS的TE（pH8.0）平衡后上柱。
　　2、将至多1ml的DNA溶液铺在Sepharase 2B柱上。
　　3、待DNA溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有0.1% SDS的TE(pH8.0)贮液瓶。
　　4、以1ml流出液为1份进行收集。
　　5、对每一管测定其OD260值 以确定哪些管中含有质粒DNA。通常质粒DNA在柱上流出的第一个峰中。
　　6、合并所有含质粒的洗脱液 用等体积的酚/氯仿(1:1)抽提 4℃下12000g离心2分钟 将上层水相转入新管。
　　7、加入2倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃下沉淀10分钟 然后4℃下12000g离心10分钟 弃去上清液。
　　8、沉淀加70%乙醇洗涤 4℃下12000g离心10分钟 弃去上清液。
　　9、沉淀真空抽干 重新溶于TE或无菌水中。

“苏研院质粒基因库” 的建立与当下中国企业及科研单位对于质粒资源在保藏及使用方面的巨大需求高度契合，一经发起就得到来自于国内不同研究科研机构、高等院校、临床医疗机构等科研专家与学术权威的积极响应。该平台将以完善的资源收集与保藏制度、强大的数据库管理系统和专业科学的分发流程，确保质粒资源库的高效有序运行，打造高水平的资源共享平台，满足各实验室在质粒资源上的需求，进而推动我国生命科学研究工作的发展。