mirna的中文名称（植物miRNA研究-文章4）

mirna的中文名称（植物miRNA研究-文章4）Fold change=log2miRNATPMinA/miRNATPMinBThe data from the TPM normalization were used to identify the differentially expressed miRNAs based on the number of genomic tags in each sample and compare the miRNA abundance among the three sets of libraries. The fold change was calculated as follows:According to the methods studied by Zhou et al. (2010) the miRNA expression levels were estimated by trans

MicroRNA-Mediated Responses to Chromium Stress Provide Insight Into Tolerance Characteristics of Miscanthus sinensis

※：翻译为google直译

Materials and MethodsPlant Materials

M. sinensis植物材料（M20100819）由四川农业大学提供，采集于四川雅安（N 29°57'30.1'' E 102°24'36.4' 1 388 m）。将幼苗种植在石英砂基质的圆形塑料盆（14.3 cm × 11 cm × 11 cm）中，并在恒温（28°C 光照/25°C）下用 1× Hoagland 营养液灌溉用于在生长室中以 12/12 h) 和湿度 (75%) 为周期的黑暗。根据初步实验，4 个月后M. sinensis的形态完全建立（Nie et al. 2017），Arduini 等人的研究表明，在 200 mg/L Cr 胁迫下表型变化最为明显。 . (2006)。因此，在生长 4 个月后，15 个盆用 200 mg/L Cr (VI; K2Cr2O7) 溶液处理。 Cr 处理后，在 0、12、24 和 72 小时收集根和叶样品（标记为 MR 和 ML）进行 miRNA 测序（MR0 和 ML0，MR12 和 ML12，MR24 和 ML24，以及 MR72 和 ML72，分别），并将所有这些样品在装有液氮的容器中快速冷冻，然后储存在-80°C以备以后提取RNA。每个样品具有三个重复。

RNA Extraction and High-Throughput Sequencing

按照制造商的说明，使用 Direct-zol™ RNA MiniPrep Kit（Zymo Research Co. CA United States）从样品中提取总 RNA。 24 个 RNA 样本（MR0 和 ML0：0 小时时的根和叶，未处理；MR12 和 ML12：用 Cr 处理 12 小时的根和叶；MR24 和 ML24：用 Cr 处理 24 小时的根和叶；以及 MR72 和 ML72：用 Cr 处理 72 小时的根和叶）送至天津 Noogene 生物信息技术有限公司（中国天津）使用 Illumina HiSeqTM2500 进行测序

Establishment of Small RNA Library and Bioinformatic Identification of miRNAs

照制造商的建议，使用 NEBNext® Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina®（NEB，美国），每个样品使用等量的 RNA（RIN 数 > 7.0）构建小 RNA 文库。将 3' 和 5' 末端接头连接到 miRNA 的两端。然后，使用 M-MuLV 逆转录酶 (RNase H–) 合成第一条 cDNA 链。 Long Amp Taq 2X Master Mix、SR Primer for Illumina 和索引 (X) 引物用于 PCR 扩增。 PCR 产物在 8% 聚丙烯酰胺凝胶上进一步纯化 (100 V 80 min)。回收对应于 140-160 bp 的 DNA 片段并溶解在 8 μl 洗脱缓冲液中。最后，使用 DNA 高灵敏度芯片在 Agilent Bioanalyzer 2100 系统上评估文库质量。在 Illumina HiSeqTM2500 平台上进行小 RNA 测序以生成原始读数。通过去除含有聚 N、带有 5' 接头污染物、不含 3' 接头或插入标签、含有聚 A 或 T 或 G 或 C、含有低质量和小于 18 nt 的读数的读数，获得干净的读数。原始数据。小 RNA 标签被映射到高粱双色参考序列 (ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-41/gff3/sorghum bicolor; Langmead et al. 2009) 以分析它们的表达和参考分布。映射的小 RNA 标签用于通过与 miRbase 20.0 对齐来识别已知的 miRNA。自定义脚本用于分别获取特定长度的已识别 miRNA 的第一个位置和所有已识别 miRNA 的每个位置的 miRNA 计数和碱基偏差。 miRNA前体的发夹结构特征可用于预测新的miRNA。 miREvo (Wen et al. 2012) 和 mirdeep2 (Friedlder et al. 2012) 软件被集成来预测新的 miRNA。已知的miRNA使用miFam.dat1鉴定家族，新的miRNA前体进一步提交给Rfam2鉴定Rfam家族。

Differential Expression Analysis of miRNAs

According to the methods studied by Zhou et al. (2010) the miRNA expression levels were estimated by transcript per million (TPM). TPM avoided the effect of quantitative accuracy and normalized the expression level of small RNAs in different sequencing amounts. TPM was calculated as follows:

TPM=readCount×1 000 000/libsize

(libsize: Sum of miRNA ReadCount of sample)

The data from the TPM normalization were used to identify the differentially expressed miRNAs based on the number of genomic tags in each sample and compare the miRNA abundance among the three sets of libraries. The fold change was calculated as follows:

Fold change=log2miRNATPMinA/miRNATPMinB

A: a sample of A time.

B: a sample of B time.

正值和负值分别表示小 RNA 的上调和下调。 Benjamini-Hochberg 方法用于调整 p 值。 p < 0.05 的值被设置为显着差异表达的阈值。 为了识别不同时间点 Cr 处理中差异表达的 miRNA，使用 Novomagic 工具生成了热图。

Target Gene Prediction Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Function Analysis

miRNA 的靶基因预测由 psRobot 中的 psRobot_tar 执行（Wu 等，2012）。 使用 NovoMagic program3 绘制维恩图。 找到miRNA的靶基因后，同样的程序被用于GO和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析。 使用R-Studio Team的GO功能包将目标基因分为三个部分：生物过程、分子功能和细胞成分。 趋势分析使用 OmicShare 工具进行。4 小 RNA 测序数据集以登录号 PRJNA595773 存入 NCBI 数据库。

Verification of miRNA by qRT-PCR Analysis

1. 选择了六种 Cr 反应性 miRNA，即 miR156a、miR167a、miR396d、miR5564a、new_miR149 和 new_miR32，用于实时定量 PCR (qRT-PCR) 分析（表 1）。
2. miRNA加尾逆转录引物用于总RNA的转录，根据Shi和Chiang的方法设计（Rui和Chiang，2005）。
3. 根据制造商的说明，使用 Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit（Clontech Laboratories Inc. Shanghai China）进行逆转录。
4. 然后使用特定正向引物（表 1）和 mRQ 3' 通用反向引物（10 μM）将 cDNA（即样本与序列相同）用于 qRT-PCR。
5. 18S rRNA 用作拖尾 qRT-PCR 的内参。使
6. 用 Bio-Rad CFX96 Touch（Bio-Rad，Hercules，CA，美国）进行 qRT-PCR。每个 20 μl 反应包含 10 μl 2× miRNA qPCR 预混液、0.8 μl (10 μM) 正向引物、0.8 μl (10 μM) 反向引物、6.4 μl 无 RNase 水和 2 μl cDNA 模板。 PCR程序在95°C下进行30 s，然后在95°C下5 s和60°C下20 s进行40个循环。反应完成后，设置熔解曲线以评估引物特异性。使用 2-△△CT 方法（Livak 和 Schmittgen，2001）计算相对表达水平。