霍乱弧菌的鉴定实验（动物源性食品中细菌的检测）

霍乱弧菌的鉴定实验（动物源性食品中细菌的检测）霍乱肠毒素致病机理如下：毒素由A和B2个亚单位组成，A亚单位又分为A1和A22个肽链，两者依靠二硫链连接。A亚单位为毒性单位，其中A1肽链具有酶活性，A2肽链与B亚单位结合参与受体介导的内吞作用中的转位作用。B亚单位为结合单位，能特异地识别肠上皮细胞上的受体。1个毒素分子由1个A亚单位和6个B亚单位组成多聚体。霍乱肠毒素作用于肠细胞膜表面上的受体（由神经节苷脂GM1组成），其B亚单位与受体结合，使毒素分子变构，A亚单位进入细胞，A1肽链活化，进而激活腺苷环化酶，使三磷酸腺苷（ATP）转化为环磷酸腺苷（cAMP），细胞内cAMP浓度增高，导致肠黏膜细胞分泌功能大为亢进，使大量体液和电解质进入肠腔而发生剧烈呕吐和腹泻，由于大量脱水和失盐，患者可发生代谢性酸中毒、血循环衰竭，甚至休克或死亡。人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者，该菌主要通过污染的水源或食物经口传播。在一定条件下，霍乱弧菌进入小

霍乱弧菌（Vibrio cholerae）是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一，曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水，死亡率甚高，属于国际检疫传染病。霍乱弧菌包括两个生物型：古典生物型和埃尔托生物型。这两种型别除个别生物学性状稍有不同外，形态和免疫学性基本相同，在临床病理及流行病学特征上没有本质的差别。

1 病原学特征

霍乱弧菌是烈性肠道感染传染病霍乱的病原菌。革兰氏阴性菌，菌体短小，大小为（1.5～2.0）μm×（0.35～0.4）μm，弯曲呈弧状或逗点状，无芽孢，无荚膜，菌体两端钝圆或稍平，菌体一端有单根鞭毛和菌毛，运动活泼（图2-9）。经人工培养后，易失去弧形而呈杆状。营养要求不高，在pH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好，因其他细菌在这一pH条件下不易生长，故碱性蛋白胨水可作为选择性增殖霍乱弧菌的培养基。在碱性平板上菌落直径为2mm，圆形、光滑、透明。

霍乱弧菌能将硝酸盐还原为亚硝酸盐，靛基质反应阳性，当培养在含硝酸盐及色氨酸的培养基中，产生靛基质与亚硝酸盐，在浓硫酸存在时，生成红色，称为霍乱红反应，但其他非致病性弧菌亦有此反应，故不能凭此鉴定霍乱弧菌。埃尔托型霍乱弧菌与古典型霍乱弧菌生化反应有所不同。前者VP试验阳性而后者为阴性，前者能产生强烈的溶血素，溶解羊红细胞，在血平板上生长的菌落周围出现明显的透明溶血环，古典型霍乱弧菌则不溶解羊红细胞，个别埃尔托型霍乱弧菌株亦不溶血。

该菌有两类抗原，即菌体O抗原和鞭毛H抗原。根据O抗原的差异，可将其分为139个血清群其中O1血清群包括了古典生物型和埃尔托生物型，两个生物型均可再分为3个血清型，即原型（稻野型）、异型（小川型）和中间型（彦岛型）。目前致病菌株主要为O139群变异株和O1群霍乱弧菌。O2～O138血清群菌株不致霍乱，可致散发性胃肠炎。

古典生物型对外环境抵抗力较弱，埃尔托生物型抵抗力较强，在河水、井水、海水中可存活1～3周，可在鲜鱼、贝壳类食物上存活1～2周。霍乱弧菌对热、干燥、日光、化学消毒剂和酸均很敏感，耐低温，耐碱；湿热55℃经15min、100℃经1～2min或水中加0.5mg/L氯15min可被杀死。0.1%高锰酸钾浸泡蔬菜、水果可达到消毒目的。在正常胃酸中仅能生存4min。

2 致病性

人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者，该菌主要通过污染的水源或食物经口传播。在一定条件下，霍乱弧菌进入小肠后，依靠鞭毛的运动，穿过黏膜表面的黏液层，黏附于肠壁上皮细胞上，在肠黏膜表面迅速繁殖，经过短暂的潜伏期后便使人迅速发病。该菌不侵入肠上皮细胞和肠腺，也不侵入血液，仅在局部繁殖和产生霍乱肠毒素，此毒素作用于黏膜上皮细胞与肠腺，使肠液过度分泌，从而使患者出现呕吐和腹泻，泻出物呈“米泔水样”并含大量弧菌，此为霍乱的典型特征。霍乱肠毒素不耐热，56℃经30min即可破坏其活性；对蛋白酶敏感而对胰蛋白酶抵抗；该毒素属外毒素，具有很强的抗原性。

霍乱肠毒素致病机理如下：毒素由A和B2个亚单位组成，A亚单位又分为A1和A22个肽链，两者依靠二硫链连接。A亚单位为毒性单位，其中A1肽链具有酶活性，A2肽链与B亚单位结合参与受体介导的内吞作用中的转位作用。B亚单位为结合单位，能特异地识别肠上皮细胞上的受体。1个毒素分子由1个A亚单位和6个B亚单位组成多聚体。霍乱肠毒素作用于肠细胞膜表面上的受体（由神经节苷脂GM1组成），其B亚单位与受体结合，使毒素分子变构，A亚单位进入细胞，A1肽链活化，进而激活腺苷环化酶，使三磷酸腺苷（ATP）转化为环磷酸腺苷（cAMP），细胞内cAMP浓度增高，导致肠黏膜细胞分泌功能大为亢进，使大量体液和电解质进入肠腔而发生剧烈呕吐和腹泻，由于大量脱水和失盐，患者可发生代谢性酸中毒、血循环衰竭，甚至休克或死亡。

3 流行病学特征

3.1 传染源

霍乱的传染源主要是患者和带菌者。重症患者吐泻物带菌较多，极易污染环境，是重要传染源。轻型患者和无症状感染者作为传染源的危险性更大。近年来已有动物（含水生动物）作为传染源的报道，值得重视。

3.2 传播途径

经水传播是霍乱弧菌最重要的传播途径。其他的传播途径还有通过食物、与病人接触和苍蝇携带等。

（1）经水传播 霍乱弧菌污染水源是酿成霍乱流行的重要原因。

（2）经食物传播 受霍乱弧菌污染的海水或江、湖中的水产品常可带有霍乱弧菌，若烹调时未彻底煮熟，食后便有染病的危险。

（3）生活接触传播。

（4）经媒介昆虫传播。

3.3 易感人群

不同年龄、不同性别的健康人对霍乱弧菌普遍易感。由于免疫水平和感染机会的多寡等因素，新疫区（非地方性疫区）中成年人多发，老疫区（地方性疫区）中幼儿多发。

3.4 流行特征

（1）地区分布 两型弧菌引起的霍乱均有地方性疫源地，印度素有“人类霍乱的故乡”之称，印度尼西亚的苏拉威西岛则是埃尔托型霍乱弧菌的疫源地，每次世界大流行都是从上述地区扩散而来。我国是外源性，历次世界大流行均受其害。

（2）季节分布 我国发病季节一般在5—11月，而流行高峰多在7—10月。

（3）流行方式 有暴发及迁延散发两种形式，前者常为经水或食物传播引起暴发流行，多见于新疫区，而后者多发生在老疫区。

4 危害

自1817年以来，全球共发生了7次霍乱世界性大流行，前6次病原是古典型霍乱弧菌，第7次病原是埃尔托型霍乱弧菌。

从1817年至1923年的100多年间，恒河三角洲地区的霍乱引发过6次世界性大流行，先后波及亚洲、非洲、欧洲和美洲的数十个国家和地区。自1961年始，埃尔托型霍乱弧菌从印度尼西亚迅速向外播散，引起了第7次世界性大流行。

霍乱在我国的流行情况：埃尔托型霍乱弧菌引起的第7次世界性大流行于1961年经广东省阳江市传入我国后，先后发生过3次大流行。在我国发生的这3次流行的病例数逐次增多，波及面越来越广，流行时间与亚洲其他地区颇为一致。

1992年10月O139霍乱首先发生于印度马德拉斯，1993年初又在印度加尔各答流行，发病者13000人以上，死亡434人。同年，在孟加拉国南部又发生流行，并沿孟加拉湾海岸向东蔓延，仅3个月共报告患者107297例，死亡1473人，3月中旬流行高峰时，达卡医院每日接受腹泻患者550～615人，较已往同期增加2～3倍。

O139群霍乱弧菌在1993年传入我国，至1994年，我国有24个省份检出O139群霍乱弧菌。因其在1992—1993年来势迅猛，其传播速度之快远超过埃尔托型霍乱弧菌，因而国际上曾有专家提出可能是“第8次霍乱流行”的开始。

1993年报告O139群霍乱流行的国家还有泰国、马来西亚、尼泊尔、沙特阿拉伯、巴基斯坦、斯里兰卡。1994年泰国报告发病3487例，缅甸仰光三角洲4月中旬也有暴发，每日就诊者100人以上，此外，美国、英国、新加坡、瑞士、日本、爱沙尼亚、德国和中国香港等国家和地区也报告有输入病例。

5 检测方法

5.1 细菌分离培养

预增菌：称取25g样品放入盛有225mL碱性蛋白胨水的无菌均质杯中，以8000～10000r/min均质1～2min，或置于盛有225mL的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min；若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。冷冻样品、干品、盐渍产品的始初增菌液放置于（37±1）℃培养（6±1）h，新鲜样品的初始增菌液放置于（41.5±1）℃培养（6±1）h。

增菌：轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mL碱性蛋白胨水中，于（41.5±1）℃培养（18±2）h。

分离培养：用接种环蘸取增菌液划线接种TCBS琼脂和ChromID Vibrio弧菌显色培养基平板上，于（37±1）℃培养（24±2）h。

可疑菌落：霍乱弧菌在TCBS上的可疑菌落形态为表面光滑，黄色，直径为2～3mm。霍乱弧菌在ChromldVibrio弧菌显色培养基上的可疑菌落形态为蓝色，蓝绿色到绿色菌落（某些弧菌如创伤弧菌及梅氏弧菌可能会产生与霍乱弧菌相似的蓝色到蓝绿色菌落）。

细菌纯化：至少应挑取5个可疑菌落传代培养。如果平板上的可疑菌落少于5个，则应该全部挑取传代培养。在氯化钠营养琼脂平板或试管斜面上接种单个可疑菌落传代培养以获得纯培养物。在（37±1）℃培养（24±2）h。

5.2 鉴定

5.2.1 显微镜下检验

（1）革兰氏染色试验 霍乱弧菌为革兰氏染色阴性，无芽孢，弧形或弯曲状。

（2）动力试验 将可疑菌落接种1管碱性蛋白胨水，在（37±1）℃培养1～6h。滴1滴菌悬液于一干净的载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下检查细菌运动性。霍乱弧菌培养物应为运动性阳性。522氧化酶试验

以无菌白色滤纸蘸取营养琼脂表面纯培养物，滴加氧化酶试剂进行氧化酶试验。如果滤纸颜色在10s内变为紫色或者深紫色，则为阳性反应。

5.2.3 氯化钠三糖铁试验

接种氯化钠三糖铁斜面，穿刺底层并划线斜面。于（37±1）℃培养箱中培养（24±3）h。

可疑的霍乱弧菌在氯化钠三糖铁斜面上的反应为底层黄色，斜面黄色，不产生硫化氢，不产气。培养不超过24h（斜面的黄色可能在24h后变为红色）。

5.2.4 生化试验

选择革兰氏染色阴性、运动性阳性、氧化酶阳性、氯化钠三糖铁试验符合霍乱弧菌特性的菌落在氯化钠营养琼脂平板或试管斜面上纯化后，进行生化试验或者采用法国生物梅里埃股份有限公司的ID32E鉴定试剂条进行生化鉴定。霍乱弧菌的生化性状见表2-9。

5.3 血清学鉴定

5.3.1 血清学凝集试验

从培养基上挑取可疑菌落与O1群及O139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。如可疑菌落在诊断血清中很快（一般在10s内）出现肉眼可见的明显凝集，在生理盐水中不凝集，则判为O1群或O139群阳性。

与O1群或O139群霍乱弧菌诊断血清及生理盐水均不凝集，且生化反应符合霍乱弧菌特性的为非O1群霍乱弧菌。

与O1群霍乱弧菌多价血清或O139群霍乱弧菌诊断血清及生理盐水均凝集的，说明菌体有自凝现象，可用胰蛋白胨大豆琼脂或脑心浸液琼脂传代，再进行凝集试验。

5.3.2 血清分型试验

与O1群多价血清凝集的霍乱弧菌可进一步用小川型、稻叶型的单价抗血清分型：与小川型单价血清凝集，但与稻叶型单价血清不凝集者为小川型；与小川型单价血清不凝集，但与稻叶型单价血清凝集者为稻叶型；与小川型、稻叶型单价血清均呈明显凝集者为彦岛型。

5.3.3 试管凝集试验

对玻片凝集反应不典型的菌株应做试管凝集试验。用生理盐水1∶20开始倍比稀释O1群霍乱弧菌多价血清，每管含稀释血清0.5mL。将被检菌在营养琼脂的16～18h培养物用0.2%甲醛生理盐水制成每毫升约含1.8×109CFU（相当于细菌标准比浊管浓度）的菌悬液，每稀释血清管加入0.5mL；另将菌悬液0.5mL加入0.5mL生理盐水作为对照。摇匀，置（37±1）℃培养3h观察初步结果。再放于4℃或室温过夜，观察最后结果。生理盐水对照不出现自然凝集，能使试验菌凝于管底呈伞状，上清液半透明者判为＋＋；能使试验菌出现＋＋凝集的血清最高稀释倍数为凝集滴度。凝集滴度达到或超过血清原效价一半即确定为O1群霍乱弧菌。

5.4 分子生物学鉴定

5.4.1 制备DNA模板

取以上碱性蛋白胨增菌液1mL加到1.5mL离心管中，12000r/min离心2min，弃上清液，用1mL双蒸水或pH7.4的PBS洗一遍，8000r/min离心5min，尽量吸干上清液；在沉淀物中加入100μL超纯水，振荡混匀，100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，上清液即为扩增模板。将上清液转移至新的离心管中，并保存在－20℃备用。

5.4.2 引物

根据霍乱弧菌特有的靶序列设计一对特异性引物。扩增片段长度为588bp。引物序列：5′-CACCAAGAAGGTGACTTTATTGTG-3′；5′-GAACTTATAACCACCCGCG-3′。

5.4.3 PCR反应体系

25μL反应体系：DNA模板2.0μL；PCR预混液1.25μL；引物1.0μL；ddH2O加至25μL。

5.4.4 PCR反应参数

95℃预变性5min；95℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸120s，30个循环；72℃后延伸5min；4℃保存。

5.4.5 电泳

用电泳缓冲液（1×TAE）制备2.0%的琼脂糖凝胶，取5μLPCR扩增产物，分别和2μL上样缓冲液混合进行点样，用DNA分子量标记物做参照，3～5V/cm恒压电泳，电泳20～40min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。

5.4.6 结果判定

在阴性对照未出现条带、阳性对照出现所有预期大小的扩增条带条件下，如检测样品未出现588bp大小的扩增条带，则可判定该样品检验结果为阴性；如检测样品出现588bp大小扩增条带，则可判定该样品结果为阳性。