荧光标记免疫技术原理：诊断试剂免疫荧光技术

荧光标记免疫技术原理：诊断试剂免疫荧光技术荧光物质受到紫外光或蓝紫光照射时，可激发成为激发态，当激发态恢复至基态时，发出荧光。荧光的特点是灵敏、特异、准确、快速。可用于标记的荧光素有：异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RIB200)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)，其中应用最广的是FITC”。对于荧光标记示踪的原理，目前常见的有以下两种情况：一是利用环境的差异而引起荧光物质的荧光发生变化，观测这种变化，间接的达到示踪目的，如：4一十七烷基一7一羟基香豆素是一种pH敏感的荧光探针，主要作用于细胞膜表面，随着细胞所处环境pH的改变而引起荧光强度的变化，观测这种变化，可以研究阳离子脂类与细胞膜的作用；二是用荧光物质标记所要研究的物质，通过监测荧光物质达到靶向追踪的目的。2，荧光标记由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床

免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。通过对免疫荧光技术的原理、标本制作、实验类型和应用的概述，全面地介绍了免疫荧光技术方法，为实际应用提供参考。

免疫荧光技术又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种免疫荧光技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位，1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体。

用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等的方法称为免疫荧光细胞(或组织)化学技术。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。

主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分作若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。

由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。

1，原理

免疫荧光技术的基本原理就是将荧光物质与待测物通过化学反应以共价键连接，通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等仪器的检测，达到定位、示踪、含量测定等目的，并被广泛地应用于生物化学、免疫学、分子生物学、病理学和诊断学等方面。

2，荧光标记

荧光物质受到紫外光或蓝紫光照射时，可激发成为激发态，当激发态恢复至基态时，发出荧光。荧光的特点是灵敏、特异、准确、快速。可用于标记的荧光素有：异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RIB200)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)，其中应用最广的是FITC”。对于荧光标记示踪的原理，目前常见的有以下两种情况：一是利用环境的差异而引起荧光物质的荧光发生变化，观测这种变化，间接的达到示踪目的，如：4一十七烷基一7一羟基香豆素是一种pH敏感的荧光探针，主要作用于细胞膜表面，随着细胞所处环境pH的改变而引起荧光强度的变化，观测这种变化，可以研究阳离子脂类与细胞膜的作用；二是用荧光物质标记所要研究的物质，通过监测荧光物质达到靶向追踪的目的。

3，荧光抗体技术

3.1标本的制备

荧光抗体技术主要靠观察切片标本上荧光抗体的染色结果作为抗原的鉴定和定位。因此标本制作的好坏直接影响到检测的结果。在制作标本过程中应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和封埋过程中不发生溶解和变性，也不扩散至临近细胞或组织间隙中去。标本切片要求尽量薄些，以利抗原抗体接触和镜检。标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去，有传染性的标本要注意安全。常见的临床标本主要有组织、细胞和细菌三大类。按不同标本可制作涂片、印片或切片。组织材料可制备成石蜡切片或冷冻切片。石蜡切片因操作烦琐，结果不稳定，非特异反应强等已少应用。组织标本也可制成印片，方法是用洗净的玻片轻压组织切面，使玻片粘上1～2层组织细胞。细胞或细菌可制成涂片，涂片应薄而均匀。涂片或印片制成后应迅速吹干、封装，置一10°C保存或立即使用。

3.2荧光抗体染色

于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体，置湿盒内，在一定温度下温育一定时间，一般25。C～37°C30rain，不耐热抗原的检测则以4°C过夜为宜，用PBS充分洗涤，干燥。

3.3试验类型

3.3.1直接法直接滴加2-4个单位的标记抗体于标本区 使之与抗原发生特异性结合，漂洗，干燥，封载。该法操作简便，特异性高 非特异炭光染色因素少;纵点是敏感度偏低，每检查—种抗原需制备相应的特异荧光抗体.

3.3.2间接法

染色程序分为两步 第一步 用末知未标记的抗休(街检标木)加到己知抗京标本上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤 除去木结合的抗体。第二步 加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、lgM抗体。如果第一生发生丁抗原抗体反应 标记的抗球蛋白抗体就会和己结合抗京的抗体进一步结合 从而可空定末知抗体，该万法的优点为制备一种标记的抗体，即可用于多和抗原抗休系统的检测。