牛精子提取，牛精液的稀释和保存方法

牛精子提取，牛精液的稀释和保存方法精子在－0.6℃以下贮藏时，精子就会发生结冻而死亡。而在－196℃下贮藏时，因使用一定的保护剂，经过一定的降解温度程序，精液便不形成冰结晶而成玻璃化状态。虽然温度大大低于冰点（－0.6℃）但对精子却无破坏作用，精子解冻后仍能复苏。精子冷冻过程中最危险温度区为－25～－15℃，因此冷冻和解冻时应快速通过这一区域。 精液保存有三种方法即常温（15～25℃）保存、低温（0～5℃）保存和冷冻保存（－196～－79℃）。3、牛精液冷冻保存（1）牛精液冷冻保存的原理

1、牛精液的稀释

精液稀释首先配制稀释液，稀释液中一般有四类成分：稀释剂、营养物、保护剂及其他。稀释液的配制准备：蒸馏水要纯净新鲜，最好自行制取；药品剂量准确，溶解、消毒应仔细；奶和奶粉应新鲜；卵黄来自新鲜鸡蛋；抗菌素为青霉素、链霉素。稀释倍数：牛一般为10～ 40倍，羊为5～10倍，猪为2～4倍，马为2～3倍，兔为4～10倍。

2、液态牛精液的保存方法

精液保存有三种方法即常温（15～25℃）保存、低温（0～5℃）保存和冷冻保存（－196～－79℃）。

3、牛精液冷冻保存

（1）牛精液冷冻保存的原理

精子在－0.6℃以下贮藏时，精子就会发生结冻而死亡。而在－196℃下贮藏时，因使用一定的保护剂，经过一定的降解温度程序，精液便不形成冰结晶而成玻璃化状态。虽然温度大大低于冰点（－0.6℃）但对精子却无破坏作用，精子解冻后仍能复苏。精子冷冻过程中最危险温度区为－25～－15℃，因此冷冻和解冻时应快速通过这一区域。

（2）牛冷冻精液的制作过程

①准备工作包括配制稀释液和采精前的准备工作。稀释液包括冷冻稀释和解冻液两种。公牛精液冷冻常用稀释配方。

②稀释第一，先用精液同温的果糖-柠檬酸钠-卵黄-甘油稀释液的第一液；按1∶1～1∶2倍进行第一次稀释。第二，将稀释过的精液，连第二液放入装冰的广口保温瓶内，使之经1小时后降温于0～5℃。第三，用0～5℃的果糖-柠檬酸钠-卵黄-甘油液的第二液，按原精的1∶1～1∶2倍进行第二次稀释。

③平衡将精液瓶放入0～5℃冰箱或冰瓶内平衡1～2小时。制作塑料细管精液，须将精液在0～5℃下装入细管，封口后再行平衡。

④冷冻根据剂型及冷源的不同，分为两类方法。颗粒冷冻法和塑料细管冷冻法。颗粒冷冻法有干冰埋藏法和液氮熏蒸法。塑料细管冷冻法有干冰埋冻法和液氮熏蒸法。液氮熏蒸法，在装有液氮的容器上置一铜沙网，铜纱网四周固定一泡沫塑料浮子，可使铜纱网漂浮于液氮面上，从而温度保持恒定。用聚四氟乙烯板代替铜纱网，先将其在液氮内浸泡几分钟后悬于液氮面上。将平衡精液按量（0.1毫升）滴于乙烯板上，停3～5分钟后，当精液冻结颜色变白时，将精液颗粒收集于袋中，贮藏于液氮中。滴冻时动作要迅速，颗粒大小要均匀。

⑤解冻细管精液解冻时，可将直接放入30～40℃的温水中，待精液融化一半时，立即取出备用。颗粒精液可采用干解冻和温解冻法。干解冻是将试管置于35～40℃水中恒温后，放入颗粒精液，摇动到融化，同时加入1毫升20～30℃解冻液。温解冻是将1～2毫升解冻稀释液倒入试管内，水浴加温至35～40℃，再放入颗粒精液，摇动至融化，取出试管在室温下存放备用。